曾富強，王 斌，李旭廷，李金良，詹素瓊，袁定勝，梁 歌

（四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066）

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，越來越多的病原菌對常用抗生素產(chǎn)生耐藥性，且耐藥程度日益加深。同時，由于化學(xué)合成藥物開發(fā)的難度大、毒副作用明顯，人們對從傳統(tǒng)天然藥物特別是中草藥中尋找抗微生物感染的新藥越來越關(guān)注。為了進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)更多的具有抗感染作用的中草藥，探索其抗菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，筆者此次對32種中草藥水提取物抑制大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌的活性進(jìn)行了篩選研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 中藥 大力子、黃柏、牛蒡子、赤芍、連翹、麻黃、秦艽、黃連、穿心蓮、馬齒莧、紫蘇子、牡丹皮、生地、苦參、山豆根、益母草、車前子、蒲公英、龍膽、大青葉、香薷、黃芩、白頭翁、黃荊、千里光、薄荷、石斛、白芷、知母、梔子、青蒿、射干等32味中藥飲片，均購自成都德仁堂藥店。

1.2 菌株 3株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）由本實驗室從臨床病例中分離保存；金黃色葡萄球菌CVCC1882，大腸桿菌CVCC2801均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 培養(yǎng)基 MH瓊脂和MH肉湯培養(yǎng)基（杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)）。

1.4 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、微量移液器等。

1.5 其他材料 96孔板。

2 方法

2.1 中藥提取物的制備 采用傳統(tǒng)水煎法。蒸餾水預(yù)先浸泡1h，加熱煎煮2次，第一次保持微沸30min，濾出藥液；藥渣加溫水再煮沸，仍保持微沸30min，濾出藥液。合并2次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至生藥含量為1 g/mL。

2.2 細(xì)菌懸液的制備 將保存菌種接種于MH肉湯中，置于37℃恒溫箱中復(fù)活16～24h。平板劃線后倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。挑取3～5個菌落于裝有生理鹽水的試管，調(diào)整渾濁度至0.5麥?zhǔn)媳葷岫龋?～2×108CFU/mL）備用。

2.3 微量肉湯法測定32種中藥提取物對金黃色葡萄球菌CVCC1882和大腸桿菌CVCC2801的MIC值 取無菌96孔板，分別于每一排的第一孔加中草藥提取物（1g/mL）200μL，其余各孔均加入 MH肉湯100μL，于第一孔取100μL藥液加入第二孔，充分混勻后再從第二孔取100μL于第三孔，以此類推，最后一孔不加藥液，作為陰性對照。同時以青霉素作為陽性對照，濃度分別為：50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.3μg/mL、3.1μg/mL、1.6μg/mL、0.8μg/mL、0.4μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0μg/mL。將稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷岫鹊拇竽c桿菌和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌懸液再稀釋100倍，并分別加入加了藥液的96孔板，每孔100μL。每排藥液的最終濃度為：500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62.5mg/mL、31.3mg/mL、15.6mg/mL、7.8mg/mL、3.9mg/mL、2.0mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0mg/mL。菌液加好后置無菌盒中，37℃恒溫箱培養(yǎng)24h。

2.4 結(jié)果判定 在黑色背景的光源下與對照組孔（包括青霉素對照、肉湯對照）作比較，檢測菌株的生長情況。若96孔板內(nèi)肉湯呈混濁生長，孔底出現(xiàn)沉淀等判斷為有菌生長；反之，澄清為無菌生長。無細(xì)菌生長孔所含的最低抗菌藥物濃度即為MIC值（最低抑菌濃度）。

最后，篩選出具有較好抑菌活性的11種中草藥提取物，用微量肉湯稀釋法測定其對3株MRSA的MIC值，以標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌作對照。

3 結(jié)果

3.1 32種中草藥提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的體外抑菌作用 結(jié)果見表1。32味中草藥提取物中，對大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株有抑菌作用的有19味，對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株有抑菌作用的有23味，同時對兩者都有抑菌作用的有16味。對金黃色葡萄球菌抑菌較強的（MIC＜100mg/mL）中藥提取物有大力子、黃柏、黃連、香薷、黃芩、千里光、薄荷、知母、梔子、青蒿、射干共11味，其MIC范圍為3.9～62.5mg/mL；對大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株抑菌較強的（MIC＜100mg/mL）中藥提取物有香薷、黃芩和梔子共3味，MIC值均為62.5mg/mL。

3.2 11種中草藥提取物對3株MRSA的體外抑菌作用 在32味中草藥中篩選了對金黃色葡萄球菌有較好抑菌作用的11味中草藥，分別對3株MRSA進(jìn)行MIC值測定，結(jié)果見表2。與標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌對照組相比，除香薷外，3株MRSA對其余10味中草藥提取物表現(xiàn)出了不同程度的耐藥，其中對梔子、大力子和薄荷完全耐藥；僅黃連、射干、黃芩、黃柏、香薷5味中藥對3株MRSA同時表現(xiàn)出抑菌活性，但黃連、射干、黃柏與對照組相比，MIC值增加了2～4倍，僅香薷的MIC值減少2～4倍。

表2 11種中草藥提取物對3株MRSA的MIC值測定

4 討論

4.1 本試驗選取的32味中草藥粗提物中有24味表現(xiàn)出不同程度的體外抑菌效果，從表1統(tǒng)計結(jié)果得出，24味中藥對金黃色葡萄球菌的抑菌效果普遍優(yōu)于對大腸桿菌的抑菌效果，其中以黃連和黃柏對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC值達(dá)到3.9mg/mL和15.6mg/mL。這與馬翀（2008）和田應(yīng)彪（2009）的研究結(jié)果一致。但本試驗中黃芩對金黃色葡萄球菌的抑菌效果與田應(yīng)彪的研究有一定差異，這可能是由于藥物的產(chǎn)地、提取工藝等不同造成的。金黃色葡萄球菌與大腸桿菌由于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的差異，對不同種類的抗生素的敏感性也不同。這可能也是造成這兩種菌對不同中藥敏感性不同的主要原因。

4.2 挑選對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株MIC＜100mg/mL的11味中草藥提取物，檢測對3株MRSA的MIC值。表2結(jié)果顯示，3株MRSA對10味中藥均表現(xiàn)出一定的耐藥性，MIC值增加了2～4倍，且對梔子、大力子和薄荷完全耐藥。目前，細(xì)菌對抗生素的耐藥性引起了世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注，而本試驗發(fā)現(xiàn)MRSA對中草藥也會產(chǎn)生耐藥性。可以推測，耐藥菌的耐藥性除了具有特異性外，還具有非特異性。即對任何危害其生存的因素都有一定的抵抗力，在藥物及環(huán)境壓力的自然選擇作用下，加快了細(xì)菌的這種非特異性抵抗力的進(jìn)化速度，使得這種能力越來越強，如細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性有所改變，細(xì)菌對藥物主動外排功能增強等。這種非特異性的耐藥性將為人類防治細(xì)菌性疾病提出更大的挑戰(zhàn)。

4.3 本試驗發(fā)現(xiàn)香薷的水煎劑對MRSA的MIC較對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC減少2～4倍，提示該藥物對MRSA有獨特的作用機制。本試驗為下一步進(jìn)行該藥物水煎劑抑菌成分的分析，作用機理研究及MRSA治療藥物的研制打下了基礎(chǔ)。

[1]陳秀樞.微量肉湯稀釋法測定MIC的評價[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志，1994，17（2）：95-98.

[2]馬翀，齊長明，王亨，等.20種中藥對奶牛乳房炎病原菌抑菌效果比較[J].中國獸醫(yī)雜志，2008，44（8）：55-57.

[3]田應(yīng)彪，陳澤慧，楊名慧，等.16種中藥水煎液對MRSA和MSSA體外抑菌試驗觀察[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29（11）：897-899.