李醫(yī) 原霞 王寶銀

抗菌藥物敏感性試驗(yàn)是一種用于考察藥物抗菌活性的體外實(shí)驗(yàn)，一般被用于抗菌藥物的初期篩選及對抗菌藥物的臨床療效進(jìn)行預(yù)測。由于抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果將直接影響到臨床使用抗菌藥物的初期篩選，因此保證抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的準(zhǔn)確合理十分重要［1］。細(xì)菌對抗生素的敏感試驗(yàn)有多種方法，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用傳統(tǒng)的瓊脂擴(kuò)散法，即K-B法。所使用的培養(yǎng)基是以水解酪蛋白為主要成分的M-H培養(yǎng)基。影響藥敏試驗(yàn)的因素也很多，如培養(yǎng)基的配制量、細(xì)菌接種量、藥敏紙片的質(zhì)量、紙片含藥的準(zhǔn)確性和均勻性等，這其中培養(yǎng)基的配制量又是重中之重，有研究證明，平板每增厚或減薄1 mm抑菌圈相應(yīng)減少或增大0.7mm。然而在包括操作規(guī)程在內(nèi)的所有資料中顯示“水解酪蛋白傾制平板，瓊脂平板厚度為4mm±1mm”。經(jīng)過反復(fù)測試后，得出了4mm瓊脂厚度只相當(dāng)于在直徑90mm平皿中加入了17毫升的培養(yǎng)基。但是在水解酪蛋白瓊脂粉的配制說明中卻提到“用吸管吸取25ml培養(yǎng)基傾注直徑90mm滅菌平皿中”。對25ml水解酪蛋白制成的培養(yǎng)皿進(jìn)行反復(fù)測量后，得出了其厚度相當(dāng)于6mm。這兩種說法之間出現(xiàn)了偏差，它們之間相差了2mm、8ml之多。那么到底是用4mm厚度做為直徑90mm滅菌平皿中M-H培養(yǎng)基的傾注厚度，還是用6mm厚度做為直徑90mm滅菌平皿中M-H培養(yǎng)基的傾注厚度呢?鑒于上述問題，本文在同一條件下分別以4mm傾注厚度和6mm傾注厚度做為兩個(gè)不同測量單位，對四種質(zhì)控菌株進(jìn)行了30次試驗(yàn)，測量其抑菌圈的直徑并把測量的結(jié)果與“4種非苛養(yǎng)菌質(zhì)控菌株對部分抗菌藥物的抑菌環(huán)允許范圍”進(jìn)行對比，力圖為K-B法手工配置的M-H培養(yǎng)基的傾注厚度提供較為準(zhǔn)確的依據(jù)和參考。

儀器與材料

一、材料和試劑

1.架盤天平(浙江省慈溪市天東衡器廠);壓力蒸汽滅菌器(山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品有限公司);90mm培養(yǎng)皿和30ml注射器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司);比濁儀和0.85%NaCl(法國梅里埃公司);水解酪蛋白瓊脂(杭州天和微生物試劑有限公司);配置用水(武漢江漢醫(yī)療制藥有限公司生產(chǎn)的水處理裝置制備的純凈水);藥敏紙片(英國Oxoid公司);藥敏判讀按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)2009年版的標(biāo)準(zhǔn)判讀。

2.質(zhì)控菌株 ATCC25922大腸埃希氏菌;ATCC25923金黃色葡萄球菌;ATCC35218含酶大腸埃希菌;ATCC27853銅綠假單胞菌;均購自衛(wèi)生部臨檢中心.

3.質(zhì)控菌株的保存 每次從血平板上挑取菌落接種于營養(yǎng)肉湯后裝成10支小瓶放于-20℃保存，每周一取1支轉(zhuǎn)種于血平皿上，周二再傳代1次，周三進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。用到最后1支時(shí)繼續(xù)前面的操作。

二、方法

1.采用K-B法分別用瓊脂厚度為4mm和瓊脂厚度為6mm的M-H培養(yǎng)基監(jiān)測四種非苛養(yǎng)菌質(zhì)控菌株對抗菌藥物的抑菌環(huán)直徑并與質(zhì)控菌株的抑菌環(huán)允許范圍進(jìn)行比較。具體藥名見表1。

2.培養(yǎng)基的制備 按要求稱取一定量水解酪蛋白瓊脂，加入純凈水，待完全溶解后放到電子萬用爐上加熱，然后放入高壓蒸汽滅菌器內(nèi)，121℃15分鐘高壓，高壓后取出并放入已消毒好的超凈工作臺(tái)內(nèi)，待自然冷卻至50℃左右，將其倒入同時(shí)進(jìn)行高壓的無菌缸內(nèi)，用30ml注射器吸取17ml和25ml分別放入無菌平皿中(在使用新注射器時(shí)先做一個(gè)“吸入-棄去”的動(dòng)作)，制成M-H培養(yǎng)基備用。每周配制一次。

3.制備菌液 菌液濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)。

4.接種平板用新的無菌棉簽蘸取調(diào)好的菌液，在液面上方管壁處旋轉(zhuǎn)擠壓幾次，擠掉過多的菌液。再用棉簽在無菌的稍干燥的M-H培養(yǎng)基表面涂布，每次將平皿旋轉(zhuǎn)60度，反復(fù)涂布6次，最后用棉簽涂抹瓊脂的邊緣。每根棉簽最多涂抹2個(gè)平皿。待培養(yǎng)皿吸收3～5分鐘的水分后，開始貼藥敏紙片。

5.貼藥敏紙片 藥敏紙片已事先從冰箱中取出并恢復(fù)了室溫，將抗菌藥物紙片貼于接種好的瓊脂平板表面。貼一個(gè)紙片用鑷子壓一下，并經(jīng)火焰滅菌鑷子尖。每個(gè)平板貼5個(gè)紙片［2］。貼完紙片后，在室溫放置了10分鐘，并將平板倒過來，置于35℃溫箱中。

6.讀取結(jié)果 孵育18～24h后，觀察結(jié)果。菌液濃度合適且涂布好，抑菌圈為正圓形，菌落呈融合生長。在黑色不反光的背景將直尺置于反轉(zhuǎn)的平板背面量取抑菌環(huán)直徑，單位為毫米。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P值＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.在ATCC25922大腸埃希菌中，具有非常顯著性意義(P值＜0.01)的藥物有氨芐西林/舒巴坦、左旋氧氟沙星、頭孢呋辛、美羅培南、呋喃妥因、復(fù)方新諾明、頭孢哌酮/舒巴坦，而具有顯著性意義(P＜0.05)的藥物有氨芐西林、頭孢噻肟。

2.在ATCC25923金黃色葡萄球菌中，具有非常顯著性意義(P值＜0.01)的藥物有左旋氧氟沙星、呋喃妥因、苯唑西林，頭孢西丁，而具有顯著性意義(P＜0.05)的藥物有青霉素、磷霉素。

3.在ATCC27853銅綠假單胞菌中，具有非常顯著性意義(P值＜0.01)的藥物有環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、頭孢他啶，具有顯著性意義(P＜0.05)的藥物有氨曲南、頭孢吡肟。

4.在ATCC35218含酶大腸埃希菌中，具有非常顯著性意義(P值＜0.01)的藥物有氨芐西林/舒巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦，而具有顯著性意義(P＜0.05)的藥物有阿莫西林/克拉維酸。

5.結(jié)果分析從表2-表5中可以看出:P值＜0.01的藥物有10種，說明用17ml做為M-H培養(yǎng)基中水解酪蛋白的灌注量對這10種藥物的結(jié)果具有非常顯著的影響。P值＜0.05的藥物有7種，說明用17ml做為M-H培養(yǎng)基中水解酪蛋白的灌注量對這7種藥物的結(jié)果具有顯著的影響。而其中氨芐西林/舒巴坦、左旋氧氟沙星、呋喃妥因這3種藥物出現(xiàn)的頻率最多，其結(jié)果受到的影響也最為明顯，說明這3種藥物所受到的影響具有普遍性。

表2 ATCC25922大腸埃希菌

表3 ATCC25923金黃色葡萄球菌

表4 ATCC27853銅綠假單胞菌

表5 ATCC35218含酶大腸埃希菌

討 論

臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的一項(xiàng)重要內(nèi)容是對病源微生物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，測定其對抗菌藥物的敏感程度，這對臨床醫(yī)師合理選用抗生素，有效控制感染，避免濫用抗生素防止耐藥株的出現(xiàn)，具有重要意義。

然而藥敏試驗(yàn)中整個(gè)過程的關(guān)鍵點(diǎn)就是藥敏培養(yǎng)基的質(zhì)量，前面也提到平板每增厚或減薄1 mm抑菌圈相應(yīng)減少或增大0.7 mm［3］。而在本次試驗(yàn)中所得到的數(shù)據(jù)為M-H培養(yǎng)基的量每增加4 ml抑菌圈的直徑增大0.9335 mm，與上述的數(shù)據(jù)相近。這說明在日常工作中藥敏結(jié)果會(huì)受到M-H培養(yǎng)基中水解酪蛋白的量的影響。培養(yǎng)基的配制量應(yīng)該是保證一切藥敏結(jié)果質(zhì)量的源頭，如果其準(zhǔn)確度從源頭上就遭到質(zhì)疑那對以后的結(jié)果將起到影響。

1 李薇，宋新波，習(xí)利平.藥物敏感性試驗(yàn)中不同方法靈敏度的比較及助溶劑的篩選［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21(8):2062.

2 Andrews JM.For the BSAC working party on susceptibility testing.BSAC standardized disc susceptibility testing method.J Antimicrob Chemother，2011，48(suppl)1:43-57.

3 張彩芳，張愛君.紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)條件的選擇［J］.寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2006，28(12):946-947.