楊利娟，黃君梅，王飛

雌激素是人體內(nèi)一種重要的內(nèi)源性物質(zhì), 在生殖、免疫、骨骼、心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，在臨床上廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP)。但是長期應(yīng)用會導(dǎo)致乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率上升等副作用[1]。因此，迫切需要尋求具有雌激素作用，但臨床副作用更小，更為安全的藥物。本研究在充分認(rèn)識骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機理的基礎(chǔ)上，以中醫(yī)“腎主骨”理論為指導(dǎo)，選取補腎中藥何首烏Polygonum multiflorumThunb、骨碎補Drynaria fartunei(Kunze)J.Sm.和淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.為研究對象，擬分別評價何首烏、骨碎補和淫羊藿粗提物及其主要成分對雌激素受體ERα和ERβ的選擇性激動作用，為其臨床應(yīng)用于骨質(zhì)疏松作用機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品

何首烏(70%乙醇提取)、骨碎補（50%乙醇提?。?、淫羊藿（水提取）浸膏由河北以嶺制藥廠提供，大黃素、大黃酸、大黃酚、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、柚皮苷（純度99%以上）均購自中國藥品生物制品檢定所。藥品用DMSO溶解備用。

1.2 試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)液、新生小牛血清、活性炭處理去內(nèi)源激素新生小牛血清、10%青鏈霉素液、胰酶購自成都哈里生物有限公司。DMSO購自美國Amresco公司。OPTI-MEM?I培養(yǎng)液購自GIBCO。17 β-Estradiol (E2)購自Sigma公司。轉(zhuǎn)染試劑Liprfectamine2000購自Invitrogen公司。XDS-1B型倒置相差顯微鏡（COIC）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo）；Varioskan F型全波長掃描式多功能讀數(shù)儀（美國Thermo）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

宮頸癌細(xì)胞（HeLa細(xì)胞）培養(yǎng)于含10%新生小牛血清、1%雙抗（青霉素，鏈霉素）的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中孵育，每周傳代一次。

1.4 質(zhì)粒

pCIneo-hERα質(zhì)粒、pIRES-hERβ質(zhì)粒、pGL3-5×ERE-Luc報告質(zhì)粒由本實驗室自行構(gòu)建，pSV-βgal內(nèi)參質(zhì)粒購自promega公司。

1.5 轉(zhuǎn)染

用含10%活性炭處理去內(nèi)源激素新生小牛血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)液將HeLa細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞密度達到70%～90%時，按Lipofectamin2000操作步驟把0.4 μg pCIneo-hERα質(zhì)?；騪IRES-hERβ、0.2 μg pGL3-5×ERE-Luc報告質(zhì)粒、0.2 μg pSV-β-gal共轉(zhuǎn)染進HeLa細(xì)胞中，6 h后換成新鮮含10%活性炭處理去內(nèi)源激素新生小牛血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)液。24 h后對照組（DMSO）和不同濃度藥物組加入相應(yīng)的孔中誘導(dǎo)報告基因Luc的表達。24 h后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗三次，每孔加入細(xì)胞裂解液200 μL。充分裂解細(xì)胞后，于4000 g離心2 min，并將上清液轉(zhuǎn)入干凈EP管，混勻后取50 μL加入熒光素酶底物檢測熒光素酶的活性，另取100 μL加入β-gal的反應(yīng)底物ONPG（鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷），于37 ℃孵育反應(yīng)30 min后，加入Na2CO3(1 mol.L-1)終止反應(yīng)，各吸取200 μL加入96孔板中用酶標(biāo)儀檢測420 nm波長吸光度值；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算β-gal的濃度對轉(zhuǎn)染效率進行校正。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，所得數(shù)據(jù)以x±SD表示，多組比較采用單因素方差分析進行比較， P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 何首烏、骨碎補和淫羊藿粗提物對ERα 和 ERβ的選擇性激動作用

為了排除何首烏、骨碎補和淫羊藿粗提物對ERE報告基因的影響，用不同濃度的中藥粗提物處理瞬時轉(zhuǎn)染pGL3-5×ERE-Luc 的HeLa細(xì)胞。結(jié)果顯示，與對照組（DMSO處理）相比，不同濃度的中藥粗提物對ERE報告基因的轉(zhuǎn)錄并無影響（見表1）。為了研究何首烏、骨碎補和淫羊藿粗提物對ERα 和 ERβ的選擇性激動作用，將ERα或ERβ分別與pGL3-5×ERE-Luc共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，加入不同濃度的中藥提取物。結(jié)果顯示，與對照組相比，各中藥提取物均可誘導(dǎo)ERE報告基因轉(zhuǎn)錄激活，并且骨碎補(100 μg.mL-1)和淫羊藿(100 μg.mL-1)對過表達ERβ的HeLa細(xì)胞作用更明顯，說明這兩種中藥提取物對ERβ的選擇性更高。

表1 三種中藥粗提物對ERE報告基因的轉(zhuǎn)錄激活作用

2.2 幾種中藥中主要單體分對ERα和ERβ的選擇性激動作用

為了排除何首烏、骨碎補和淫羊藿主要單體成分對ERE報告基因的影響，用不同濃度的單體化合物處理瞬時轉(zhuǎn)染pGL3-5×ERE-Luc 的HeLa細(xì)胞。結(jié)果顯示，與對照組（DMSO處理）相比，不同濃度的單體化合物對ERE報告基因的轉(zhuǎn)錄并無影響（見表2）。為了研究何首烏、骨碎補和淫羊藿主要單體成分對ERα 和 ERβ的選擇性激動作用，將ERα或ERβ分別與pGL3-5×ERE-Luc共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，加入不同濃度的單體化合物。結(jié)果如表2所示，與對照組比較，發(fā)現(xiàn)何首烏的主要成分大黃素、骨碎補的主要成分柚皮苷和淫羊藿的主要成分淫羊藿苷能顯著誘導(dǎo)ERE報告基因轉(zhuǎn)錄激活，并且對過表達ERβ的HeLa細(xì)胞作用更明顯。

表2 三種中藥主要單體成分對ERE報告基因的轉(zhuǎn)錄激活作用

3 討論

由于目前臨床上治療骨質(zhì)疏松癥主要應(yīng)用的是化學(xué)合成藥物，這些化學(xué)合成藥物均存在一定的副作用，利用天然中草藥及其制劑治療該病已成為醫(yī)藥界研究的熱點。在用于治療骨質(zhì)疏松的中藥中，補腎中藥淫羊藿、骨碎補和何首烏在臨床上應(yīng)用較廣, 但其作用機制尚不明確。研究已經(jīng)證實，雌激素在骨代謝平衡中起重要的調(diào)節(jié)作用,它可直接抑制造血干細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生刺激破骨細(xì)胞前增殖的細(xì)胞因子而且能直接抑制成熟破骨細(xì)胞分化, 促進破骨細(xì)胞的凋亡從而抑制骨吸收[11]。鑒于這些理論基礎(chǔ)，我們研究何首烏、骨碎補和淫羊藿抗骨質(zhì)疏松中藥中的植物雌激素作用物質(zhì)成分，從而為這三種中藥臨床應(yīng)用于骨質(zhì)疏松作用機制研究提供重要的理論依據(jù)。

雌激素的經(jīng)典作用機制認(rèn)為 ,雌激素首先與激素受體上的配體結(jié)合區(qū)（ligand binding domain,LBD）結(jié)合使得受體分子形成二聚體 ,從而使得ER的DNA結(jié)合區(qū)(DNA binding domain,DBD)與基因啟動上的雌激素反應(yīng)元件結(jié)合，啟動基因轉(zhuǎn)錄。研究表明，ERα和ERβ與雌激素或選擇性雌激素調(diào)節(jié)劑結(jié)合后，能激活不同基因的轉(zhuǎn)錄，這可能就是在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中，ERα和ERβ發(fā)揮不同作用來治療骨質(zhì)疏松癥的原因[12]。Cvoro等人發(fā)現(xiàn)，ERβ受體的選擇性激活作用能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，這樣選擇性結(jié)合ERβ受體的植物雌激素更加有助于減少治療骨質(zhì)疏松的副作用[13]。

本研究中，首先在缺乏ER的HeLa細(xì)胞中分別加入何首烏、淫羊藿和骨碎補這三種中藥的粗提物，結(jié)果表明這三種中藥的粗提物對ERE報告基因并沒有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，而在過表達ERα或ERβ的HeLa細(xì)胞中，各中藥提取物均可誘導(dǎo)ERE報告基因轉(zhuǎn)錄激活，說明何首烏、骨碎補和淫羊藿中具有植物雌激素作用的物質(zhì)成分。為了進一步證實這三種中藥中植物雌激素的主要物質(zhì)成分是哪幾種化合物，我們按照同樣的方法分別考察了何首烏、骨碎補和淫羊藿中的主要活性物質(zhì)，結(jié)果顯示何首烏主要活性成分大黃素、骨碎補中的柚皮苷和淫羊藿中的淫羊藿苷均能顯著產(chǎn)生植物雌激素作用。其中，淫羊藿苷對ERβ的作用更強，表明對ERβ的選擇性可能是這些中藥在臨床上具有治療骨質(zhì)疏松作用，但是副作用較小的原因之一。對何首烏、骨碎補和淫羊藿治療骨質(zhì)疏松的作用機制上具有重要的參考價值。

[1] Scheibor MD, Rebar RW.Isof l avones and postmenopausabone health:A Viable Alternative to Estrogen Therapy?[J].Menopause,1999,6(3):233.

[2] 羅瑞芝,賈偉,趙利斌,等.何首烏研究進展[J].中草藥,2005,36(7):7901.

[3] 朱鐵英.何首烏化學(xué)成分研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,17(2):172.

[4] 高穎,房德敏.骨碎補黃酮類化合物的研究進展與開發(fā)前景[J].中草藥,2009,40(2):323.

[5] Matsuda H,Shimoda H,Morikawa T,et al.Phytoestrogen from the roots of polygonum cuspidatum( Polygonaceae):structure-Requirement of hydroxyanthraquinones for estrogenic activity[J].Bioorg Med Chem Lett ,2001 ,11 :1839.

[6] Usui T, Ikeda Y, Tagami T, et al.The phytochemical lindleyin.islolated from Rhei rhizoma , mediates hormonal effects through estrogen receptors[J].Endocrinol ,2002 ,175 :289.

[7] 史鳳芹,于世鳳,張潤荃,等.大黃對破骨細(xì)胞性骨吸收作用的研究[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志,1995 ,9 :193.

[8] 鄒麗宜,吳鐵.何首烏防治骨質(zhì)疏松癥的研究進展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2011,27(22):3418.

[9] 于燕,顏虹,胡森科.淫羊藿提取物的雌激素樣作用研究[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2009,30(3):373.

[10] Chang E J, Lee W J, Ch o S H, et al.Proliferative effects of fl avan-3-ols and propelargonidins from rhizomes of Drynaria fortunei on MCF -7 and osteoblastic cells [J].Arch Pharm Res, 2003, 26( 8) : 620.

[11] SudaT,UdagawaN,NakamuraI,et al.Modulation of osteoclast differentiation by local factors[J].Bone,1995 , 17 ( 2 Supp l):87S.

[12] Tee, M.K., Rogatsky, I., Tzagarakis-Foster, et al.Estradiol and selective estrogen receptor modulators differentially regulate target genes with estrogen receptors α and β[J].Molecular Biology of the Cell ,2004,15:1262.

[13] Cvoro, A., Paruthiyil, S., Jones, J.O., et al.Selective activation of estrogen receptor-β transcriptional pathways by an herbal extract[J].Endocrinology,2007,148: 538.