杜 洪，陰懷清，閆煥利，范澤衛(wèi)，郭晉偉

缺氧缺血性腦?。℉IE）是引起新生兒急性死亡和慢性神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要原因之一［1］。促紅細(xì)胞生成素（EPO）對缺氧缺血的腦組織有保護(hù)作用［2］，但其作用機(jī)制尚未完全清楚。本實(shí)驗(yàn)通過建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷（HIBD）模型，觀察EPO對新生大鼠HIBD后腦組織HIF－1α及凋亡相關(guān)蛋白存活素（Survivin）表達(dá)的影響，探討其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 一抗：兔抗鼠HIF－1α和Survivin，二抗：即用型SABC試劑盒，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（POD），均購自武漢博士德公司。DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。人重組促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）系成都地奧九泓制藥廠生產(chǎn)。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備 清潔級，封閉群，新生7dWistar大鼠120只，體重12g～16g，雌雄不限，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為假手術(shù)組、HIBD組、rhEPO治療組，后兩者根據(jù)處死時(shí)間亞組：3h組、6h組、12h組、24h組、48h組、3d組、7d組，每組8只。假手術(shù)組給予麻醉后切開頸部皮膚，不結(jié)扎頸總動(dòng)脈，不進(jìn)行缺氧處理。采用經(jīng)典Rice法［3］制成HIBD動(dòng)物模型。rhEPO治療組給予麻醉后切開頸部皮膚，結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈并置于缺氧倉中（含8%氧氣）2h，模型建立后，分別于缺氧缺血后即刻、24h、48h各時(shí)間點(diǎn)連續(xù)腹腔注射rhEPO（5 000IU／kg）。

1.3 標(biāo)本制備 分別在3h、6h、12h、24h、48h、3d、7d處死各組動(dòng)物，斷頭取左側(cè)腦組織，10%多聚甲醛室溫固定24h，切塊，石蠟包埋后，連續(xù)做冠狀切片。

1.4 免疫組化

1.4.1 HIF－1α的檢測 切片經(jīng)常規(guī)脫蠟后放置至蒸餾水中，3%H2O2室溫孵育15min，枸櫞酸緩沖液高壓熱修復(fù)2.5min，降 溫至室溫，PBS液洗2min×3次，滴加HIF－1α的一抗（1∶200），濕盒置于4℃冰箱中過夜，復(fù)溫至室溫，PBS液洗2 min×3次，滴加二抗：抗兔IgG抗體。用DAB顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染。脫水，透明，中性樹膠封片。陰性對照切片用PBS液代替一抗，余步驟相同。

1.4.2 Survivin的檢測 用Survivin的一抗代替 HIF－1α的一抗，稀釋至濃度1∶100，余步驟與HIF－1α的檢測相同。陰性對照切片也用PBS液代替一抗，余步驟相同。

1.5 圖像分析 采用BI－2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），免疫反應(yīng)產(chǎn)物用陽性細(xì)胞平均灰度值表示。

1.6 TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡 采用TUNEL法定量觀察凋亡細(xì)胞。光鏡下觀察，胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。高倍鏡下（×400）在缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)隨機(jī)選取10個(gè)非重疊視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性率即凋亡指數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK－q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 HIF－1α和Survivin的免疫組化染色 光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，HIF－1α和Survivin陽性染色均呈棕黃色的細(xì)顆粒沉積，陽性細(xì)胞主要表達(dá)于大腦皮層和海馬，陽性著色位于胞質(zhì)和（或）胞核。陰性對照片中未見該免疫反應(yīng)產(chǎn)物。

2.1.1 HIF－1α的表達(dá)在假手術(shù)組中弱或無表達(dá)，在缺氧缺血后3h即增強(qiáng)，12h達(dá)高峰，后逐漸降低（P＜0.01）；rhEPO治療組12h、24h、48h、3d的HIF－1α蛋白表達(dá)水平較 HIBD組均明顯減少（P＜0.05）。詳見表1。

表1 HIF－1α在新生大鼠腦組織中表達(dá)（x±s） 平均灰度值

2.1.2 Survivin的表達(dá) Survivin的表達(dá)在假手術(shù)組中弱或無表達(dá)，在缺氧缺血后12h開始增高，7d明顯增高，與假手術(shù)組相比，除3h、6h組，其余均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；rhEPO治療組12h、24h、48h、3d的Survivin表達(dá)水平較 HIBD組均明顯增高（P＜0.05）。詳見表2。

表2 Survivin在新生大鼠腦組織中的表達(dá)（x±s） 平均灰度值

2.2 神經(jīng)細(xì)胞凋亡的變化 細(xì)胞AI值在假手術(shù)組中較低，在缺氧缺血后6h增加，7d明顯增高，與假手術(shù)組相比，除3h組，其余差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；rhEPO治療組24h、48h、3 d、7d細(xì)胞AI較HIBD組明顯降低（P＜0.05）。詳見表3。

表3 細(xì)胞AI在新生大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)中的變化（x±s） %

3 討 論

EPO是一種糖蛋白激素，最初發(fā)現(xiàn)由腎和胎肝產(chǎn)生，通過其受體EPOR發(fā)揮作用［4］。EPOR在多種細(xì)胞與組織上都有表達(dá)，包括神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞。EPO不僅是一種造血生長因子，而且具有神經(jīng)營養(yǎng)活性［5］，正常腦組織EPO和EPOR均呈低水平表達(dá)，在缺氧缺血時(shí)表達(dá)均上調(diào)，提示有神經(jīng)保護(hù)作用。而外源性EPO生物活性與天然分離的EPO完全相同，并已被證明可通過血腦屏障來彌補(bǔ)內(nèi)源性EPO的不足以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［6］。其保護(hù)作用機(jī)制可能包括抗神經(jīng)元凋亡、抗谷氨酸興奮毒性、抗氧化作用、抗炎作用、減少NO的過度生成、促進(jìn)血管生成、促進(jìn)神經(jīng)元再生和神經(jīng)營養(yǎng)作用等。但EPO是否可以通過減少HIF－1α的過度表達(dá)，及上調(diào)Survivin表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，國內(nèi)外報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)觀察EPO對新生大鼠HIBD時(shí)腦組織HIF－1α、Survivin表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制，為EPO的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

HIF－1是近年來在哺乳動(dòng)物細(xì)胞低氧反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)的一種核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其生物活性由α亞基決定，HIF－1α表達(dá)嚴(yán)格受細(xì)胞氧濃度的調(diào)節(jié)［7］。HIF－1的下游靶基因有100多個(gè)，涉及多種功能［8］。研究發(fā)現(xiàn)，HIF－1α具有雙重作用，對細(xì)胞發(fā)揮著凋亡和促凋亡的作用。而Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員。是至今發(fā)現(xiàn)作用最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白之一，Survivin既能抑制細(xì)胞凋亡，又能誘導(dǎo)調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的有絲分裂及生長周期時(shí)相，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖和血管生成等［9］。

本研究結(jié)果表明，HIF－1α于HIBD后3h開始增高，12h達(dá)高峰，后降低，因此推測，缺氧狀態(tài)下HIF－1α穩(wěn)定表達(dá)，隨著大鼠恢復(fù)氧供，HIF－1α即通過泛素蛋白酶體迅速降解，因而表現(xiàn)為先升后降的趨勢，證實(shí)缺氧并非是誘導(dǎo)HIF－1α表達(dá)增加的唯一機(jī)制，可能還與缺氧缺血時(shí)間及嚴(yán)重程度有關(guān)。這與李麗華等［10］觀察趨勢基本一致。近年對Survivin的研究主要集中在腫瘤方面［11，12］，Survivin在正常成人組織中不表達(dá)，而在顱腦損傷后高表達(dá)［13］。

本研究結(jié)果顯示，新生鼠HIBD后腦細(xì)胞開始凋亡，Survivin早期升高不明顯，HIF－1α表達(dá)明顯升高，提示HIF－1α的表達(dá)與細(xì)胞凋亡同步，參與了缺氧缺血后腦損傷過程。其可能機(jī)制為：HIBD后HIF－1α過度表達(dá)時(shí)，介導(dǎo)一系列基因轉(zhuǎn)錄、激活，導(dǎo)致神經(jīng)毒性，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞。HIF－1α在缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用［14］。鄭湘榕等［15］研究表明新生鼠腦缺氧缺血可誘導(dǎo)HIF－1α基因的表達(dá)，可能促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Survivin的表達(dá)抑制了HIBD后腦組織細(xì)胞凋亡，可能機(jī)制是通過直接或間接作用于天冬氨酶特異性的半胱氨酸酶實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞凋亡的抑制，發(fā)揮腦保護(hù)作用；同時(shí)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖和血管生成參與了損傷后的修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)新生鼠腦缺氧缺血可誘導(dǎo)HIF－1α及Survivin蛋白的表達(dá)，二者共同參與了HIBD過程。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rhEPO治療組HIF－1α的表達(dá)降低，而Survivin的表達(dá)在HIBD后升高，且細(xì)胞凋亡明顯減少，表明外源性EPO在早期可通過減少HIF－1α的表達(dá)，提高Survivin表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而達(dá)到抑制缺氧缺血后腦神經(jīng)元凋亡。從而在新生鼠HIBD時(shí)發(fā)揮其腦保護(hù)作用，這可能是EPO腦保護(hù)作用機(jī)制之一，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，rhEPO治療組7d時(shí)Survivin的表達(dá)反而降低，避免了因Survivin的過表達(dá)而引起腫瘤細(xì)胞的發(fā)生，這可能與機(jī)體Survivin自身的調(diào)控機(jī)制有關(guān)。

本研究為EPO用于臨床治療新生兒缺血缺氧性腦病提供了理論依據(jù)。但如何應(yīng)用EPO調(diào)節(jié)HIF－1α活性的動(dòng)態(tài)平衡，使其盡可能發(fā)揮對腦損傷有力的作用，尚有待于進(jìn)一步研究。

［1］ Allemand F，Reale F，Sposato M，et al.Perinatal hypoxic－ischemic en－cephalopathy：E pileptic and paretic outcome at one year of age［J］.Ital J Pediatr，2009，35（1）：14.

［2］ 陳曉晴，許華，羅小平，等.促紅細(xì)胞生成素對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織存活素表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2011，26（2）：91－93.

［3］ Rice JE，Vannucci RC，Brierley JB.The influence of immaturity on hypoxic－ischemic brain damage in the rat［J］.Ann Neurol，1981，9（2）：131－141.

［4］ Hasselblatt M，Ehrenreich H，Siren AL.The brain erythropoietin system and its potential for therapeutic exploitation in brain disease［J］.J Neurosurg Anesthesiol，2006，18（2）：132－138.

［5］ Maiese K，Hou J，Chong ZZ，et al.Erythropoietin，forkhead proteins，and oxidative injury：Biomarkers and biology［J］.Sci World J，2009，9：1072－1104.

［6］ Mengozzi M，Cervellini I，Bigini P，et al.Endogenous erythropoietin as part of the cytokine network in the pathogenesis of experimental autoim mune encephalom yelitis［J］.Mol Med，2008，14（11－12）：682－688.

［7］ Chandel NS，Budinger GR.The cellular basis for diverse responses to oxygen［J］.Free Radic Biol Med，2007，42（2）：165－174.

［8］ 鄒崢，劉小惠，鄒大衛(wèi).缺氧缺血性腦損傷［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2011，26（18）：1446－1449.

［9］ Conte MS，Altieri DC.Survivin regulation of vascular injury［J］.Trends Cardiovasc Med，2006，16（4）：114－117.

［10］ 李麗華，屈藝，張莉，等.HIF－1α表達(dá)在新生大鼠缺氧／缺氧缺血性腦損傷神經(jīng)元凋亡中的作用［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，39（6）：912－915.

［11］ Guha M，Altieri DC.Survivin as a global target of intrinsic tumor suppression networks［J］.Cell Cycle，2009，8（17）：2708－2710.

［12］ Mita AC，Mita MM，Nawrocki ST，et al.Survivin key regulator of mitosis and apoptosis and novel target for cancer therapeutics［J］.Clin Cancer Res，2008，14（16）：5000－5005.

［13］ Johnson EA，Svetlov SI，Wang KK，et al.Cell－specific DNA fragmentation may be attenuated by a surviving－dependent mechanism after traumatic brain injury in rats［J］.Exp Brain Res，2005，167（1）：17－26.

［14］ Halterman MW，Miller CC，F(xiàn)ederoff HJ.Hypoxia－inducible factor－1alpha mediates hypoxia－induced delayed neuronal death that involves P53［J］.Neurosci，1999，19：6818－6824.

［15］ 鄭湘榕，楊于嘉，賈延劼.新生大鼠缺氧缺血性腦組織缺氧誘導(dǎo)因子－1α的表達(dá)及其與神經(jīng)元凋亡關(guān)系的研究［J］.中華兒科雜志，2003，41：366－367.