楊秀麗，張文高，師 冉，鄭廣娟

載脂蛋白E基因敲除（Apolipoprotein－E knockout，ApoEKO）小鼠能夠在自然膳食下形成嚴(yán)重的高脂血癥，并自發(fā)形成纖維斑塊和復(fù)合斑塊，病理學(xué)改變與人類極為相似，因此廣泛應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的研究中［1］。本研究以ApoEKO小鼠為動(dòng)物模型，研究脂欣康對(duì)海馬形態(tài)學(xué)及膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）與突觸素（P38）表達(dá)的影響，為健脾益氣法改善認(rèn)知功能障礙提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 32周齡ApoEKO小鼠，30只，雄性，體重32.5 g±1.0g；32周齡C57BL／6J小鼠，10只，雄性，體重30.9g±1.2g，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科技部提供。

1.2 藥物與試劑 脂欣康膠囊由濟(jì)南孟氏生物科技研究所有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：衛(wèi)食健字（2001）第0010號(hào)，生產(chǎn)批號(hào)：20041106；維生素E（VitE）由浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：040323。DAB顯色試劑盒、多聚賴氨酸，兔抗膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶單克隆抗體，小鼠抗神經(jīng)P38單克隆抗體，由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 分組與給藥 將30只ApoEKO小鼠隨機(jī)分為ApoEKO組、脂欣康組、聯(lián)合干預(yù)組，每組10只。分別給予生理鹽水、脂欣康混懸液（0.008g／d），脂欣康混懸液（0.008g／d）＋VitE［100 mg／（kg·d）］灌胃；10只C57BL／6J小鼠作為正常對(duì)照組，給予等量生理鹽水灌胃。每日灌胃一次，連續(xù)給藥60d。

1.4 HE染色及光鏡觀察 取視交叉到乳頭體部位的腦組織，按照常規(guī)浸蠟、石蠟包埋，HE染色，在光鏡下觀察拍照。

1.5 圖像采集與計(jì)算機(jī)定量分析 將石蠟切片置于37℃的烤箱內(nèi)烘烤過(guò)夜，常規(guī)免疫組織化學(xué)ABC法。使用HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)（武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司），在相同的背底倍體條件下選擇相應(yīng)的參數(shù)進(jìn)行計(jì)算機(jī)完全定量分析，測(cè)定3個(gè)視域陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度及陽(yáng)性細(xì)胞率，代表蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPPSS13.0處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡觀察

2.1.1 HE染色 ApoEKO組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞層次紊亂，有神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死、凋亡，有神經(jīng)纖維脫髓鞘，膠質(zhì)細(xì)胞輕度增生，間質(zhì)水腫、疏松呈網(wǎng)狀改變，有灶狀炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。各治療組上述病理學(xué)改變明顯減輕，聯(lián)合干預(yù)組的療效明顯優(yōu)于脂欣康組。

2.1.2 膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶免疫組化染色 ChAT免疫陽(yáng)性產(chǎn)物為黃褐色，主要位于神經(jīng)元胞漿及近側(cè)突起內(nèi)，細(xì)胞核未著色或著色較淡，被染成深藍(lán)色。與C57BL／6J小鼠相比，ApoEKO組小鼠海馬區(qū)的ChAT陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，胞漿ChAT陽(yáng)性染色變淺，有膠質(zhì)細(xì)胞增生。與ApoEKO組小鼠相比，脂欣康組與聯(lián)合干預(yù)組的ChAT陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增多，聯(lián)合干預(yù)組增多尤為明顯。

2.1.3 突觸素蛋白免疫組化染色 P38的免疫陽(yáng)性產(chǎn)物為顆粒狀，顆粒產(chǎn)物有的分布在神經(jīng)元內(nèi)，有的顆粒圍繞在神經(jīng)元周圍，顆粒大小不一。與C57BL／6J小鼠相比，ApoEKO組小鼠海馬內(nèi)P38陽(yáng)性染色顆粒明顯減少，染色較淺，膠質(zhì)細(xì)胞增多。與ApoEKO組小鼠相比，脂欣康組與聯(lián)合干預(yù)組相同區(qū)域的P38染色加深，P38陽(yáng)性染色顆粒增多，聯(lián)合干預(yù)組增多尤為明顯。

2.2 計(jì)算機(jī)定量分析

2.2.1 膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶 與C57BL／6J小鼠比較，ApoEKO組小鼠海馬ChAT平均灰度值明顯增高，陽(yáng)性率明顯降低（P＜0.01），各干預(yù)組平均灰度值與陽(yáng)性率介于兩者之間。詳見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠海馬區(qū)ChAT平均灰度值和陽(yáng)性率比較（x±s）

2.2.2 突觸素蛋白 與C57BL／6J小鼠比較 ApoEKO組小鼠海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)P38平均灰度值明顯增高，而陽(yáng)性率明顯降低（P＜0.05），各干預(yù)組平均灰度值與陽(yáng)性率介于兩者之間。詳見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠海馬區(qū)P38平均灰度值和陽(yáng)性率比較（x±s）

3 討 論

ApoE在中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育過(guò)程中的生理功能，以及在疾病、外傷時(shí)都發(fā)揮著重要作用。早期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，ApoEKO小鼠出現(xiàn)神經(jīng)突觸與細(xì)胞骨架的破壞，以及海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)能力減弱［2］。Masliah等［3］通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法使ApoEKO小鼠重新獲得ApoE基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ApoEKO小鼠的認(rèn)知障礙得到明顯改善，而且ApoEKO小鼠損壞的突觸、突起等神經(jīng)結(jié)構(gòu)也得到修復(fù)，這既支持AapoE的神經(jīng)保護(hù)作用，也提示AapoE存在潛在的治療價(jià)值。本研究HE染色顯示，ApoEKO小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞層次欠規(guī)則，神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死、凋亡，同時(shí)可見(jiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，證實(shí)ApoEKO小鼠存在海馬神經(jīng)結(jié)構(gòu)的損害。

腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的退化是老年癡呆患者學(xué)習(xí)記憶功能減退的主要原因之一，ChAT是參與乙酰膽堿（Ach）合成的限速酶，ChAT的活性和含量直接影響Ach的合成與含量，因此檢測(cè)ChAT能夠間接估計(jì)Ach含量或釋放量［4］。ChAT與AD患者學(xué)習(xí)記憶功衰退間存在明顯的因果關(guān)系［5，6］。本研究中發(fā)現(xiàn)，ApoEKO組小鼠的ChAT免疫組化陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞明顯少于C57BL／6J小鼠，這可能是由于海馬區(qū)大量神經(jīng)元損傷所致。與C57BL／6J小鼠相比，ApoEKO組小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯減少，同時(shí)可見(jiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，ChAT免疫組化染色淺。本研究團(tuán)隊(duì)既往的研究發(fā)現(xiàn)［7］，幼齡ApoEKO小鼠存在明顯的認(rèn)知功能障礙，但給予足夠的訓(xùn)練后，幼齡ApoEKO小鼠的表現(xiàn)能夠達(dá)到正常C57BL／6J小鼠的認(rèn)知水平。ApoE的缺失導(dǎo)致ApoEKO小鼠海馬神經(jīng)元損傷，進(jìn)而導(dǎo)致ChAT含量及活性明顯下降，使Ach生成減少，最終導(dǎo)致海馬區(qū)信息傳遞過(guò)程出現(xiàn)障礙，這可能是ApoEKO小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降的潛在原因。

突觸素首先由 Wiedenmann等［8］發(fā)現(xiàn)，它是位于突觸小泡膜上的特異性糖蛋白，分子量為38ku，因此常被簡(jiǎn)稱為P38，是突觸小泡的標(biāo)志性蛋白，通過(guò)檢測(cè)P38的免疫反應(yīng)性，可以間接反映突觸的數(shù)量、分布和密度［9］。P38實(shí)際上參與了突觸小泡的形態(tài)發(fā)生與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程［10］，因此成為突觸功能的標(biāo)志蛋白。P38的免疫活性在腦組織高度集中在突觸前軸突末梢內(nèi)，圍繞著神經(jīng)元和其樹(shù)突，因此該蛋白也被廣泛應(yīng)用于標(biāo)記軸突終末，是突觸重建與修復(fù)的重要標(biāo)志［11］，P38含量的高低能夠反映突觸神經(jīng)功能的高低，包括突觸的神經(jīng)信息傳遞、遞質(zhì)釋放等功能。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與C57BL／6J小鼠相比，ApoEKO組小鼠的海馬區(qū)P38陽(yáng)性表達(dá)顯著降低。最終表現(xiàn)在行為學(xué)上出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力的明顯減弱。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，P38含量的增加與ChAT的增加是一致的，這表明膽堿能神經(jīng)損傷改善后，能夠?yàn)橥挥|的修復(fù)與改建提供物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)而改善突觸的結(jié)構(gòu)與功能。

脂欣康膠囊由人參、銀杏葉、三七、綠茶提取物和牛磺酸組成，功能是益氣養(yǎng)心健脾，活血通絡(luò)，化痰降濁，為補(bǔ)通結(jié)合，標(biāo)本兼顧之劑?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，脂欣康各成分EGb、人參皂甙、PNS、GTP、?；撬岬榷加写龠M(jìn)動(dòng)物模型學(xué)習(xí)記憶功能的作用，而且它們對(duì)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)或改善作用［12－14］。本實(shí)驗(yàn)中，脂欣康組小鼠相應(yīng)腦區(qū)的ChAT與P38表達(dá)明顯優(yōu)于ApoEKO組，提示脂欣康能夠明顯減輕ApoE缺失導(dǎo)致的小鼠皮層與海馬神經(jīng)損傷；但與C57／BL 6J小鼠相比，脂欣康不能完全逆轉(zhuǎn)ApoE缺失導(dǎo)致的膽堿功能損害，不能完全恢復(fù)ApoEKO小鼠的突觸異常。聯(lián)合干預(yù)組的療效優(yōu)于脂欣康組，提示脂欣康與VitE間具有協(xié)同作用。

本研究團(tuán)隊(duì)既往的研究成果顯示［15］，脂欣康能夠部分改善ApoEKO小鼠的認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能是多靶點(diǎn)多途徑的，維護(hù)突觸結(jié)構(gòu)與功能以及調(diào)控突觸重建是其可能的作用機(jī)制之一。

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