孔 瑜，蘭麗珍，張繼敏

嚴(yán)重的糖尿病并發(fā)癥糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）也已經(jīng)成為引起終末性腎衰最重要的原因之一。免疫炎癥反應(yīng)在DN發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著極為重要的作用［1，2］。Toll樣受體4（Toll－like receptor 4，TLR4）是免疫反應(yīng)重要的上游調(diào)節(jié)因子，可通過調(diào)控其下游信號核因子－κB（NF－κB）誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)，激活免疫炎癥反應(yīng)。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是炎癥反應(yīng)中巨噬細(xì)胞重要的趨化因子。TLR4、OPN的表達(dá)參與糖尿病腎病的發(fā)展過程，且抑制其表達(dá)可以減少腎臟的損傷。胰高血糖素樣肽－1（GLP－1）是一種由腸道L細(xì)胞分泌的腸促胰島素激素，Exendin－4是從動物唾液中分泌的天然GLP－1類似物，是一種新型降糖藥物，其能夠抑制免疫炎癥反應(yīng)，從而改善DN腎臟損傷，起到保護(hù)腎臟的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 HK－2細(xì)胞，來自于中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心，GLP－1類似物Exendin－4原粉由東莞寶麗健生物工程研究開發(fā)有限公司提供。免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物有限公司。TLR4、OPN引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 HK－2的培養(yǎng)及分組 體外培養(yǎng)HK－2細(xì)胞，用含8%的胎牛血清，1%復(fù)方氨基酸的DMEM低糖培養(yǎng)基。分組，低糖組（5.5mmol／L），高 糖 組 （30mmol／L），高 滲 透 壓 組 （30 mmol／L甘露醇的DMEM培養(yǎng)基），Exendin－4低劑量干預(yù)組（30mmol／L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基，10pmol／L Exendin－4），Exendin－4中劑量干預(yù)組（30mmol／L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基，20pmol／L Exendin－4），Exendin－4高劑量干預(yù)組（30mmol／L葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)基，40pmol／L Exendin－4），分別培養(yǎng)48h。

1.3 細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測TLR4、OPN蛋白的表達(dá) 將HK－2細(xì)胞接種于6孔板中制備爬片，用4%多聚甲醛固定1h。分別滴加TLR4稀釋的一抗（兔IgG），OPN稀釋的一抗（兔IgG），4℃過夜。滴加生物素化山羊抗兔IgG 37℃孵育30min，滴加試劑SABC 37℃孵育20min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染。圖像用BI－2000測定TLR4、OPN陽性表達(dá)的平均光密度值。

1.4 RT－PCR法檢測 TLR4、OPN mRNA的表達(dá) 收集細(xì)胞，加入1mL Trizol，用1ml注射器反復(fù)混勻，充分破碎和溶解細(xì)胞提取總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取2μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR循環(huán)，TLR4引物序列為，上游引物：5′－tgagcagtcgtgctggtatc－3′；下游引物：5′－cagggcttttctgagtcgtc－3′，合成產(chǎn)物為167bp。OPN引物序列為，上游引物5′－tgaaacgagtcagctggatg－3′；下游引物5′－tgaaattcatggctgtggaa－3′；合成產(chǎn)物為162bp，內(nèi)參β－actin引物序列為，上游序列5′－agagctacgagctgcctgac－3′，下游序列5′－agcactgtgttggcgtacag－3′，合成產(chǎn)物為184bp。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，活化Tag酶；94℃15s，60℃60s，45個循環(huán)結(jié)束。反應(yīng)以β－actin CT值為內(nèi)參照，目的基因擴(kuò)增用CT值，應(yīng)用2－△△CT法應(yīng)用熒光定量TL980PCR儀進(jìn)行定量分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用SPSS16.0分析，采用單因素方差分析（one－wayANOVA）。

2 結(jié) 果

2.1 各組 HK－2細(xì)胞中TLR4、OPN蛋白的表達(dá)水平TLR4、OPN的陽性表達(dá)均表達(dá)于HK－2細(xì)胞的胞漿。低糖組和高滲透壓組TLR4、OPN均呈弱陽性表達(dá)。與低糖組比較，高糖組TLR4、OPN的表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。與高糖組比較，Exendin－4不同劑量的干預(yù)組中TLR4、OPN的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），且表達(dá)呈劑量依賴性，但仍高于低糖組（P＜0.05）。詳見表1。

表1 體外培養(yǎng)HK－2細(xì)胞中TLR4、OPN蛋白的表達(dá)（x±s）

2.2 HK－2細(xì)胞中TLR4、OPN mRNA的表達(dá) RT－PCR結(jié)果顯示。高糖組中TLR4、OPN mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。Exendin－4干預(yù)組中TLR4、OPN mRNA的表達(dá)較高糖組明顯降低，且呈劑量依賴性，但表達(dá)仍高于低糖組（P＜0.05）。詳見表2。

表2 體外培養(yǎng)HK－2細(xì)胞TLR4、OPN mRNA水平（x±s）

3 討 論

糖尿病腎病的發(fā)生，是高血糖通過復(fù)雜交錯的通路如糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的形成，蛋白激酶C（PKC）的激活，以及活性氧簇（ROS）的產(chǎn)生等多種途徑下導(dǎo)致腎臟損傷［1］。研究發(fā)現(xiàn)［3］AGEs，AngⅡ通過激活TLR4，可進(jìn)一步活化 NF－κB信號途徑，開始一系列的炎癥反應(yīng)。同時，在鏈霉素誘發(fā)的DM大鼠模型中，高糖、氧化應(yīng)激、局部RAS系統(tǒng)激活、PKC途經(jīng)活化均引起腎小管OPN表達(dá)增加［4］。

本研究證明，在低糖和高滲透壓培養(yǎng)的HK－2細(xì)胞中，TLR4、OPN蛋白及mRNA水平呈低表達(dá)，然而在高糖干預(yù)48 h后，細(xì)胞中TLR4、OPN表達(dá)明顯增高。這表明TLR4、OPN的高表達(dá)不受滲透壓的影響，而是在高糖的刺激下通過多種途徑被激活，導(dǎo)致了各種炎癥因子（IL－1、IL－6、TNF－α）釋放，巨噬細(xì)胞遷移活化及腎小管間質(zhì)纖維化，引起糖尿病腎病。

GLP－1類似物不僅能降低血糖、保護(hù)β細(xì)胞、減少體重，還能夠呈劑量依賴性的激活過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）－α，發(fā)揮降脂和改善腎小球免疫炎癥反應(yīng)的效應(yīng)，來延緩糖尿病腎病的進(jìn)展［5］。前期研究證明［6］，Exendin－4通過調(diào)節(jié)DN大鼠模型脂代謝的異常，抑制蛋白尿水平及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，達(dá)到腎臟保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)［7］Exendin－4在治療劑量下能夠通過改善代謝紊亂抑制腎小球高濾過，炎癥細(xì)胞的浸潤及細(xì)胞凋亡等腎臟損傷。Ishibashi等［8］指出GLP－1類似物還可直接與腎小球內(nèi)皮細(xì)胞上GLP－1受體結(jié)合，通過激活CAMP途徑來抑制AGEs與其受體結(jié)合，從而抑制AGEs引起的免疫炎癥反應(yīng)，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，Exendin－4干預(yù)48h后，HK－2細(xì)胞中TLR4、OPN蛋白及mRNA的表達(dá)較高糖組均有明顯下調(diào)，且在藥物安全劑量下呈劑量依賴性，隨Exendin－4劑量的增加，TLR4、OPN的表達(dá)明顯降低，高劑量干預(yù)組表達(dá)的下調(diào)更加明顯。由此推斷，Exendin－4可能是通過降低血糖，抑制代謝紊亂產(chǎn)生的AGEs，AngⅡ等活性，從而減少TLR4、OPN的生成，阻斷了下游信號通路NF－κB激活，相關(guān)炎癥因子的表達(dá)和巨噬細(xì)胞浸潤，達(dá)到改善腎小管間質(zhì)纖維化，腎臟保護(hù)作用。

TLR4是介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)的主體［9］，有研究認(rèn)為，TLR4可通過激活NF－κB，來激活其下游炎癥因子OPN的表達(dá)，TLR 4、OPN的表達(dá)呈顯著相關(guān)性。由此還可以認(rèn)為Exendin－4抑制高糖誘導(dǎo)的HK－2細(xì)胞OPN的表達(dá)，可能與下調(diào)TLR4的表達(dá)有關(guān)。

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