范澤衛(wèi)，陰懷清

缺氧缺血性腦?。╤ypoxic－ischemic encephalopathy，HIE）是由于各種圍生期窒息導(dǎo)致胎兒或新生兒腦缺氧缺血性損傷，臨床出現(xiàn)一系列腦病的表現(xiàn)，是我國傷殘兒童致殘重要的原因之一。目前國際上無公認(rèn)有效方法，低氧誘導(dǎo)因子－1α（HIF－1α）是調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)平衡的主要調(diào)節(jié)因子，具有神經(jīng)保護作用。尋找能夠增加內(nèi)源性HIF－1α表達(dá)的藥物對治療缺氧缺血性腦損傷（HIBD）有很大的意義。本實驗通過建立新生大鼠HIBD模型，觀察去鐵胺（DFO）對HIBD后新生大鼠腦組織HIF－1α及Caspase－3表達(dá)的影響，探討HIF－1α的作用機制，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 HIF－1α、活化的半胱天冬氨酸酶3，多克隆抗體（兔抗）、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自武漢博士德公司；去鐵胺（得斯芬）諾華制藥（NOVARTIS）。

1.2 動物分組 清潔級，封閉群，新生7日齡 Wistar大鼠120只，體重12g～16g，雌雄不限（由山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供）。隨機分為假手術(shù)組、HIBD組、DFO組，后兩者根據(jù)處死時間的不同隨機分為7個亞組（3h、6h、12h、24h、48h、3d、7 d），每組8只。假手術(shù)組給予麻醉后切開頸部皮膚，不結(jié)扎頸總動脈不進行缺氧處理；HIBD組采用經(jīng)典Rice法［1］制成HIBD動物模型：乙醚吸入麻醉后切開頸部皮膚，結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，并置于缺氧艙中（含8%氧氣和92%氮氣）2h，控制氧濃度在（8.0±0.5）%，艙溫（37±1）℃；去鐵胺組，制成 HIBD動物模型前24h以去鐵胺（200mg／kg，溶于生理鹽水）單次腹腔內(nèi)注射。

1.3 免疫組化標(biāo)本采集及監(jiān)測 術(shù)后不同時間點斷頭取腦組織，10%多聚甲醛室溫固定24h后沿視交叉和其后4mm處冠切，做石蠟包塊蠟塊冠狀切片，常規(guī)脫蠟；3%H2O2室溫孵育15 min；枸櫞酸緩沖液中高壓抗原修復(fù)；滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫中孵育15min；滴加一抗：兔抗鼠HIF－1α抗體或兔抗大鼠Caspase－3抗體；滴加生物素化二抗：抗兔IgG抗體，37℃烤箱孵育15min，PBS液洗2min×3次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S－A／HRP），37℃烤箱孵育15min，PBS液洗2min×3次；用DAB顯色劑顯色；蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。陰性對照切片用PBS液代替一抗，余步驟相同。

1.4 圖像及數(shù)據(jù)分析 采用BI－2000圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），免疫反應(yīng)產(chǎn)物用陽性細(xì)胞平均灰度值表示。

1.5 TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡 采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位末端標(biāo)記法（TUNEL）進行腦細(xì)胞凋亡檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK－q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化染色 光鏡觀察，HIF－1α、Caspase－3陽性染色呈棕黃色的細(xì)顆粒沉積，陽性細(xì)胞主要表達(dá)于大腦皮層和海馬，陽性著色主要位于胞核和（或）胞質(zhì)。陰性對照片中未見該免疫反應(yīng)產(chǎn)物。

2.2 腦組織HIF－1α表達(dá)比較 假手術(shù)組HIF－1α表達(dá)弱或無表達(dá)；HIBD組3h表達(dá)輕度增高，12h達(dá)高峰，然后逐漸降低，7d仍保持一定的表達(dá)水平，其各時間點表達(dá)高于假手術(shù)組（P＜0.05）。而DFO組則6h達(dá)高峰，12h和24h仍在較高水平，與缺氧缺血組比較各時間點HIF－1α蛋白表達(dá)均增多（P＜0.05）。詳見表1。

表1 不同時間點腦組織HIF－1α表達(dá)比較（陽性細(xì)胞平均灰度值）（x±s）

2.3 不同時間點腦組織Caspase－3表達(dá)的變化 假手術(shù)組Caspase－3表達(dá)弱，HIBD組缺氧缺血側(cè)腦組織Caspase－3各時間點表達(dá)高于假手術(shù)組（P＜0.05）；DFO組各時間點Caspase－3表達(dá)低于HIBD組（P＜0.05）。詳見表2。

表2 不同時間點腦組織Caspase－3表達(dá)的變化（陽性細(xì)胞平均灰度值）（x±s）

2.4 不同時間點新生大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)中（細(xì)胞AI）的變化TUNEL陽性細(xì)胞（AI指數(shù)）表達(dá)主要分布于皮層及海馬區(qū)。假手術(shù)組TUNEL陽性細(xì)胞極少，HIBD組TUNEL陽性細(xì)胞較對照組增多，且隨著時間延長逐漸增多，7d達(dá)高峰（P＜0.05）。DFO組TUNEL陽性細(xì)胞比HIBD組明顯降低（P＜0.05）。詳見表3。

表3 不同時間點新生大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)中（細(xì)胞 AI）的變化（x±s） %

3 討 論

HIF－1是缺氧反應(yīng)信號通路的調(diào)控因子，是缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞所產(chǎn)生的一種轉(zhuǎn)錄因子，由α和β兩個亞基組成，HIF－1α既是調(diào)節(jié)亞基又是活性亞基［2］，無論是在全身缺氧，腦半球性缺血，腦局灶性缺血時，腦組織中都發(fā)現(xiàn)有HIF－1α的激活。在新生鼠HIBD時HIF－1α具有神經(jīng)保護作用，可以通過調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)減少神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。鐵離子螯合劑（DFO）是鐵絡(luò)合劑，研究發(fā)現(xiàn)DFO對HIBD引起的損傷有保護作用，其作用機制與引發(fā)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生NO和環(huán)磷酸腺苷（cGMP）的信號通路，PKG激活，線粒體鉀敏感ATP通道開放和活性氧產(chǎn)生有關(guān)［3］。近年發(fā)現(xiàn)去鐵胺能誘導(dǎo)HIF－1基因表達(dá)，增加HIF－1與DNA結(jié)合活性，促進HIF－1α表達(dá)［4，5］。DFO在缺血性腦損傷時具有神經(jīng)保護作用，減少梗死面積和腦水腫［6］，其作用可能通過上調(diào)腦組織HIF－1α和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)，促進缺氧缺血腦組織新生血管形成，減輕缺氧缺血性腦損傷。在新生兒HIBD時HIF－1α表達(dá)及DFO的調(diào)節(jié)機制還不十分清楚。

本研究結(jié)果表明，在新生鼠HIBD時，3h表達(dá)輕度增高，12 h達(dá)高峰，然后逐漸降低，表現(xiàn)為先升后降的趨勢，表明缺氧并非是誘導(dǎo)HIF－1α表達(dá)增加的唯一機制，可能還與缺氧缺血時間及嚴(yán)重程度有關(guān)。Baranova等［7］報道腦缺血后HIF－1α的激活存在兩個時程：第一時程發(fā)生在缺血后12h之前，此時，大部分促進凋亡或壞死的基因被上調(diào)；12h之后HIF－1α大部分上調(diào)基因則與促進存活和修復(fù)相關(guān)。提示HIF－1α在缺血的急性和慢性期發(fā)揮了不同的作用。常氧HIF－1α極不穩(wěn)定，經(jīng)泛素蛋白酶體路徑迅速降解［8］。用氯化鈷（CoCl2）或者去鐵敏（DFX）在缺血缺氧前24h進行預(yù)處理，可以分別產(chǎn)生75%和56%的腦保護作用［9］。DFX預(yù)處理可以改善體外缺氧（OGD）引起的海馬神經(jīng)元的死亡，這一保護作用機制也來源于對HIF表達(dá)的影響［10，11］。本研究結(jié)果表明，DFO組6h達(dá)高峰，12h和24h仍在較高水平，與缺氧缺血組比較各時間點HIF－1α蛋白表達(dá)均增多。在缺氧或常氧狀態(tài)下均可調(diào)節(jié)HIF－1α的表達(dá)，在常氧下，DFO通過抑制鐵依賴的脯氨酸羥化酶活性穩(wěn)定HIF－1α，缺氧缺血時DFO可抑制鐵依賴脯氨酸羥化酶活性，使HIF－1α蛋白經(jīng)泛素蛋白酶體降解減少，從而造成蛋白積聚HIF－1α蛋白表達(dá)增加。

Caspcse－3是近年來用于檢測凋亡細(xì)胞的可靠指標(biāo)［12］，Caspase家族蛋白酶具有在細(xì)胞中過表達(dá)即可自身激活并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特性，Caspcse－3通過破壞、激活某些酶或破壞細(xì)胞骨架蛋白等方式，最終導(dǎo)致特異性DNA斷裂，這種DNA片段可能是腦缺氧缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的早期特征。proaaspase－3的裂解產(chǎn)物和HIF－1共同表達(dá)于缺血半暗帶甚至非損傷組織中，并提出了HIF－1通過功能性結(jié)合Caspase－3基因啟動子而激活Caspase－3的因果關(guān)系。研究認(rèn)為［13］Caspase－3與HIF－1的相互作用可能依賴于缺血性腦損傷的持續(xù)時間和嚴(yán)重程度。HIBD組缺氧缺血側(cè)腦組織Caspase－3，3h開始表達(dá)，6h明顯升高，12h和24h仍在較高水平，Caspase－3蛋白表達(dá)隨著缺氧缺血時間的延長逐漸增加，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)也逐漸增加，考慮是由于HIF－1α蛋白表達(dá)逐漸減少，其調(diào)節(jié)的相關(guān)靶基因表達(dá)減少，對神經(jīng)有保護作用的因子減少，導(dǎo)致?lián)p傷加重，凋亡細(xì)胞數(shù)增加。

實驗表明，DFO對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷可能具有保護作用，減少凋亡，其類似物應(yīng)用必將為新生兒缺氧缺血性腦病的治療開辟新的道路，其具體機制還有待于進一步探索。

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