盧昌均，鹿俊磊，安紅偉，劉國成，周哲屹，韋冰心，陸兵勛，尹瑞雪，王立新

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異的強效有絲分裂原［1］。缺血性腦損傷后，盡早恢復(fù)缺血半暗帶的血供有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)。腦缺血再灌注損傷時，VEGF可通過與其受體結(jié)合發(fā)揮促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用，加速新生血管的形成。因此，制作大鼠缺血再灌注損傷（MCAO）模型，采用反轉(zhuǎn)錄集合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－PCR）檢測缺血再灌注損傷后不同時間點神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化相關(guān)細(xì)胞因子VEGF mRNA的變化，并研究通心絡(luò)膠囊對其表達(dá)的影響，探討通心絡(luò)膠囊在缺血性腦損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 栓線制備 采用3－0號尼龍線，線頭一端用酒精燈將其燙成球形，在需要長度處折彎作標(biāo)記，將此線浸泡消毒后，栓線頭端浸入0.1%多聚賴氨酸溶液中過夜，60℃烤箱中1h后取出，然后浸入1.25×104U肝素鹽水中備用。

1.2 動物模型制作 選用健康雄性SD大鼠180只，體重250 g±20g，南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。隨機分為缺血再灌注3d、5d、14d、30d共四批次進(jìn)行，每批次隨機分為通心絡(luò)劑量組、缺血再灌注模型對照組（等量的生理鹽水）和假手術(shù)組，每組12只。參考改良的線栓法大鼠缺血性及缺血再灌注模型改進(jìn)。放入栓線后用消毒鋼尺量自頸總動脈分叉處的血管外線長度，計算栓線實際的進(jìn)入長度。在穿刺點外5mm剪斷殘留的栓線，埋于胸鎖乳突肌下。手術(shù)后縫皮，消毒切口，在缺血后90 min拔出線栓形成缺血再灌注動物模型。根據(jù)經(jīng)典的Zea Longa神經(jīng)功能評分法評分（5級4分法）［2］。除假手術(shù)組外，各組選取造模后6h神經(jīng)功能缺損評分在2分以上的大鼠納人試驗研究，癥狀輕微（0分及1分）的大鼠剔除。假手術(shù)組也插入栓線，但深度為10mm左右，不阻塞大腦中動脈。術(shù)后大鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水，在約20℃的空調(diào)環(huán)境下單籠飼養(yǎng)。

1.3 給藥方法 先將通心絡(luò)膠囊內(nèi)容物溶于蒸餾水中配成溶液，通心絡(luò)組按每只1g／（kg·d）給藥，MCAO模型對照組、假手術(shù)組用等量蒸餾水分別灌胃，每組大鼠在再灌注清醒后即灌胃給藥，每日2次，給藥時間分別為3d、5d、14d、30d。

1.4 腦組織制備 將每組大鼠于末次腹腔注射BrdU后24h，在10%水合氯醛麻醉下，迅速斷頭取出腦組織，放入特制的小盒內(nèi)，緩緩平放入盛有液氮的小杯中，當(dāng)盒底接觸液氮時即開始?xì)饣序v，10s～20s后腦組織迅速冰結(jié)成塊，取出腦組織冰塊立即置入－70℃冰箱中備用。

1.5 腦組織總RNA提純分離 大鼠缺血再灌注后3d、5d、7 d和14d、21d、30d各組腦缺血側(cè)、缺血對側(cè)區(qū)腦組織，以及通心絡(luò)治療后缺血側(cè)腦組織，提取總RNA。進(jìn)行RT－PCR及半定量分析，以2% 瓊脂糖－TBE凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像；采用gel pro軟件分析，以目的片段與β－actin的光密度比值（D）作為目的片段mRNA的相對含量，分離PCR產(chǎn)物，以DL－2000Marker為參照物。

引物設(shè)計：參考Genbank核普酸序列資料，應(yīng)用Oligo5.0軟件程序設(shè)計有意義引物，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成純化。其具體設(shè)計如下：

2 結(jié) 果

2.1 腦組織總RNA的提取結(jié)果 二條分別代表RNA的18 s，28s清晰條帶，電泳圖譜28s和18s酶比值約為2∶1，說明實驗中的RNA完整無降解。

2.2 缺血再灌注模型組與通心絡(luò)組VEGF mRNA表達(dá) 假手術(shù)組幾乎檢測不到VEGF mRNA的表達(dá)；大鼠腦缺血再灌注后在病灶對側(cè)僅見少量VEGF mRNA表達(dá)；缺血再灌注模型組及通心絡(luò)組病灶側(cè)VEGF mRNA在不同時間段均有表達(dá)，并隨時間延長其表達(dá)增加，第5、7天最高，第14天時表達(dá)開始下降，但通心絡(luò)組同一時間點VEGF mRNA的表達(dá)均較模型組增強。

3 討 論

缺血性腦損傷后，動脈血管閉塞而致局部腦血流減少，腦組織缺血、缺氧，產(chǎn)生神經(jīng)組織損傷。缺血半暗帶的理論是由Astrup等1981年根據(jù)動物實驗首次提出的，此區(qū)域存在側(cè)支循環(huán)，部分血流可供應(yīng)此區(qū)域，尚有大量神經(jīng)元存活，如果血液迅速恢復(fù)，腦代謝得以改善，損傷仍然可逆，神經(jīng)細(xì)胞仍可存活并恢復(fù)功能，這種可逆性取決于血管的新生和側(cè)支循環(huán)的形成。腦缺血再灌注損傷時，VEGF可通過與其受體結(jié)合而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，加速新生血管的形成，提高血管通透性，并以自分泌、旁分泌和胞內(nèi)分泌的方式特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞受體，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長、增殖、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)降解、血管管型結(jié)構(gòu)形成［3］。

缺血半暗帶在缺血性腦損傷后雖然有神經(jīng)功能的缺失，但仍有潛在的存活能力，神經(jīng)細(xì)胞仍可存活并恢復(fù)功能，因此，急性腦梗死治療的關(guān)鍵是保護(hù)這些可逆性的神經(jīng)元。有研究發(fā)現(xiàn)［4］，VEGF促進(jìn)梗死區(qū)周圍血管側(cè)支循環(huán)的建立，改善了血流動力學(xué)狀況和疾病預(yù)后。在新生血管生成方面VEGF及其受體具有特異性，因此在缺血性腦損傷中，研究VEGF及其受體對神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用已成為目前國內(nèi)外研究的熱點。VEGF參與許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括中風(fēng)、腦缺血的神經(jīng)保護(hù)。最近的研究表明，VEGF增強缺血后的神經(jīng)再生［5］。缺血或缺氧可促使VEGF及其受體的mRNA和蛋白表達(dá)、生物活性均增加［6］。本實驗提示，缺血損傷組在術(shù)后第3天即可檢測到VEGF的表達(dá)，第5天達(dá)到高峰，第14天VEGF的表達(dá)開始下降，第30天恢復(fù)到基線水平；而假手術(shù)組幾乎檢測不到VEGF的表達(dá)，從而證實了缺血性腦損傷誘導(dǎo)了VEGF的表達(dá)。

祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)將本病歸屬于缺血性中風(fēng)的范疇，國家中醫(yī)藥管理局腦病急癥協(xié)作組將中風(fēng)病定位在腦和腦脈，指出缺血性中風(fēng)的病機是腦脈痹阻，與致病因素瘀最為緊密，因此治療此病的方法為活血化瘀藥，通過活血、疏通血脈、祛痰通絡(luò)從而達(dá)到治療目的。通心絡(luò)膠囊是目前臨床上治療缺血性腦血管病的常用藥物，在治療缺血性腦血管疾病中己經(jīng)取得了顯著療效；但其作用機制及作用靶點尚不完全清楚。本研究以通心絡(luò)為干預(yù)因素，觀察VEGF在通心絡(luò)組及缺血對照組中變化，結(jié)果顯示：通心絡(luò)能夠促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，降低缺血后神經(jīng)功能的評分，使VEGF mRNA表達(dá)明顯增加，從而推斷通心絡(luò)膠囊能夠激活神經(jīng)干細(xì)胞的增殖或者分化，促進(jìn)VEGF基因的表達(dá)，這可能是通心絡(luò)膠囊治療缺血性腦血管疾病的機制之一。

VEGF表達(dá)的調(diào)控可能涉及多種機制，包括受一系列激素、生長因子和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，受一些癌基因、抑癌基因的表達(dá)產(chǎn)物調(diào)節(jié)，特別是缺血、缺氧的刺激作用［7］，缺血性腦損傷通過誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)而發(fā)揮血管生成和神經(jīng)保護(hù)的作用。本實驗提示，通心絡(luò)可能通過促進(jìn)VEGF大量表達(dá)，使新生血管的形成增加及側(cè)支循環(huán)的建立，降低了神經(jīng)功能的缺失，這為臨床運用通心絡(luò)治療缺血性腦血管病提供了有利的證據(jù)。本實驗還觀察到，在各時間點缺血對照組VEGF基因表達(dá)水平均低于通心絡(luò)組，通心絡(luò)組5d后VEGF mRNA開始增加，晚于缺血對照組，在以后的各時間點觀察值均高于缺血對照組，一直持續(xù)到第30天；而對照組VEGF mRNA表達(dá)已回歸至基線水平。因此，推斷通心絡(luò)中的某種成分可能促進(jìn)了細(xì)胞表達(dá)VEGF或者表達(dá)該基因的細(xì)胞增加，但其具體機制還不清楚。本實驗僅研究了通心絡(luò)在基因水平對VEGF mRNA表達(dá)的影響，對于其在蛋白水平的表達(dá)尚未涉及；具體通心絡(luò)中何種成分發(fā)揮作用，以及其作用機制如何尚有待進(jìn)一步的探討。

［1］ Ferrara N.History of discovery：Vascular endothelial growth factor［J］.Arterioscler Thromb Vasc Boil，2009，29（1）：22－24.

［2］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84－91.

［3］ Cook KM，F(xiàn)igg WD.Angiogenesis inhibitions：Current strategies and future prospects［J］.Ca Cancer J Clin，2010，60（4）：222－243.

［4］ Lanfranconi S，Locatelli F，Corti S，et al.Growth factors in ischemic stroke［J］.J Cell Mol Med，2011，15（8）：1645－1687.

［5］ Ma Yihui，Qu Yan，F(xiàn)ei Zhou.Vascular endothelial growth factor in cerebral ischemia［J］.J Neu Res，2011，89（7）：969－978.

［6］ 周榮峰，鄧茜.芪棱湯對腦缺血再灌注損傷大鼠VEGF、CD34的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2011，6（20）：922－923.

［7］ 謝婧，魏有東.阿托伐他汀抑制急性腦梗死患者炎癥反應(yīng)與增強血管修復(fù)［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2010，39（6）：82－84.