張?zhí)N慧

中醫(yī)藥在治療高血壓方面具有整體性、多途徑、多層次、副反應優(yōu)勢，本著為治療高血壓及預防靶器官損害開辟新途徑的原則，從微血管增殖因子入手，研究桑仙降壓顆粒對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）心肌微血管密度（MVD）和內(nèi)皮抑素（ES）的干預，并深入分析其作用機制。

1 材料與方法

1材料

1.1 動物與分組 4周齡SHR，雌雄各半，體重200g～240g，由中國醫(yī)學科學院阜外心血管醫(yī)院提供（醫(yī)動字第01－108號）。4周齡 Wistar大鼠，雌雄各半，體重210g～250g，由山東醫(yī)科大學動物室提供［動物合格證號：SCXK（魯）20090001］。以A標示正常對照組即 Wistar大鼠組；B、C、D分別標示SHR不同的給藥方式，B組，SHR給予蒸餾水為空白對照組；C組，SHR給予桑仙降壓顆粒為實驗組，D組，SHR給予吲噠帕胺為西藥對照組；觀測事項點：0組的觀測時間為 Wistar大鼠、SHR4周齡；1、2的觀測時間為 Wistar大鼠、SHR給藥后4周、8周。根據(jù)不同觀測時間隨機分組，A組分為A0、A1、A2，B0、B1、B2，C1、C2，D1、D2。

1.2 藥物 桑仙降壓顆粒組方有桑寄生、淫羊藿、丹參、川芎等，由山東中醫(yī)藥大學中藥制劑室按正交試驗法優(yōu)選工藝制成，每克含生藥6g，臨用前加蒸餾水稀釋成含生藥0.8g／mL的藥液。吲噠帕胺片每粒2.5mg，由天津力生制藥股份有限公司提供制備成混懸液。

1.3 試劑 Anti－ESM1，美國Santa cruz公司產(chǎn)品；CD34抗體為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；生物素化山羊抗兔IgG，鏈霉親和素2生物素（SABC）和DAB顯色劑均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.4 實驗儀器 METTLER AE20型電子分析天平，海特勒托利多上海儀器有限公司提供；康樂電熱恒溫水浴槽，上海醫(yī)療器件七廠提供 ；光學顯微鏡，由山東省中醫(yī)院病理科提供。

1.5 制備 用戊巴比妥鈉（40mg／kg）體重腹腔注射，麻醉后立即經(jīng)腹主動脈注入4℃生理鹽水，切開下腔靜脈放血，待沖洗液干凈無色后，立即開胸，快速分離，摘取心臟，置入4℃生理鹽水中快速沖洗3次。

1.6 CD34標記MVD 采用免疫組化SP法。參照AXIOTIS等［1］的標準，由兩位病理醫(yī)生采用盲法（獨立檢測）在高倍鏡（×400）下讀片。每張切片高倍鏡下隨機選取10個不重復的視野，共記錄1 000個細胞，綜合染色強度和陽性細胞數(shù)量進行判定。①按切片中細胞著色深淺評分：0分為細胞無顯色；1分為黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。②按陽性細胞數(shù)占同類細胞數(shù)的百分比評分：1分為＜25%；2分為≥25%且≤50%；3分為＞50%且≤75%；4分為＞75%。取 ①、②兩項評分的乘積作為總積分：0～3分為（－）；＞3分且≤6分為（＋）；＞6分且≤9分為（＋＋）；＞9分（＋＋＋）。（－／＋）為低表達，（＋＋／＋＋＋）為高表達。

1.7 ES蛋白的表達 每張切片高倍鏡下隨機選取10個不重復的視野，共記錄1 000個細胞。其結(jié)果判定同CD34。

1.8 統(tǒng)計學處理 計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用SPSS17.0處理。

2 結(jié) 果

2.1 CD34表達 實驗前與正常對照組 CD34（9.50±0.68）分Waster大鼠相比，空白對照組心肌CD34（7.28±0.47）分表達明顯減少（P＜0.05）。實驗4周，與空白對照組比較，試驗組與西藥對照組CD34表達均有增多趨勢（P＞0.05）；實驗8周，與空白對照組比較，試驗組與西藥對照組CD34表達均明顯增多（P＜0.05），試驗組與西藥組相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 實驗4周、8周各組大鼠CD34表達積分（x±s）分

2.2 ES蛋白的表達 實驗前，空白對照組ES蛋白光密度值為（4.93±1.21）分，與正常對照組（3.51±0.77）分相比有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗4周，空白對照組ES蛋白光密度值升高（P＜0.05）。與空白對照組比較，試驗組與西藥對照組ES蛋白光密度值均有降低（P＜0.05）。實驗8周，空白對照組ES蛋白光密度值明顯升高，與正常對照組相比存在有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與空白對照組比較，試驗組與西藥對照組ES蛋白光密度值均明顯降低（P＜0.01）。試驗組與西藥對照組相比無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

表2 實驗4周、8周各組大鼠ES蛋白密度值表達積分（x±s） 分

3 討 論

高血壓病是以體循環(huán)動脈壓增高為主要表現(xiàn)的臨床綜合征，長期還可成為多種心血管疾病的重要危險因素，并影響重要臟器如心、腦、腎的功能，常造成多系統(tǒng)、多臟器的損害［2］。然微血管擔負組織器官的物質(zhì)轉(zhuǎn)運功能［3］，且微血管的改變普遍存在于各期EH。因此，改善微血管稀少應成為降壓治療的有效措施。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)微血管稀少與某些微血管抑制因子有關，而在抑制微血管增殖的因子中，內(nèi)皮抑素（ES）是高效、特異的血管抑制因子，在微血管密度改變、內(nèi)皮細胞表達抑制中起著重要作用［4］。

據(jù)報道ES是1997年O’Reilly等［5］從培養(yǎng)的小鼠內(nèi)皮細胞瘤（EOMA）上清中分離純化的一種內(nèi)源性血管生成抑制劑，為20kd分子量蛋白質(zhì)。Endostin能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞中12%的人類基因組表達，能下調(diào)促血管形成基因（BFGF－A、bFGF、EGFR、Bc1－2等）的表達，上調(diào)抗血管形成基因（ThrombosPondin－1、HIF－1AN、EPhrinB3等）的表達，雙向調(diào)節(jié)病理性血管發(fā)生；下調(diào)8個促血管形成信號傳遞途徑：I d和AP－1信號途徑（控制細胞增殖）、HIF 1信號途徑（降低氧消耗 ）、ePhfin和TNF信號途徑（控制細胞遷徙）、NF－κB信號途徑（控制細胞增殖和抗凋亡）、STAT信號途徑（控制細胞增殖和遷徙）、Ets信號途徑（控制細胞遷徙和抗凋亡）以及凝血級聯(lián)和黏附分子途徑［6］。Endostatin觸發(fā)的是信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，具有廣泛的抗血管形成活性引［7］。另外，Endostatin通過與核仁素受體結(jié)合，抑制核仁素的磷酸化而發(fā)揮抑制內(nèi)皮細胞增殖的作用；抑制某些腫瘤相關基質(zhì)金屬蛋白酶原的激活，并與MMP－2的活性部位結(jié)合，從而抑制血管內(nèi)皮細胞遷徙［8］。

因此本研究從標識MVD的CD34表達及ES密度值兩個方面出發(fā)，觀測到4周齡SHR已出現(xiàn)CD34表達減少，并隨增齡而加重，同時還觀察到SHR心肌ES蛋白光密度值升高，并隨周齡增加而顯著升高，桑仙降壓顆粒、吲噠帕胺用藥4周后，均可增加CD34表達、降低ES蛋白密度值，實驗8周后，兩藥仍具顯著作用。其機制可能與其降低ES表達密切有關，是否還與其他微血管抑制因子變化有關尚待進一步研究。

［1］ Abraham JA，Mergia A，Whang L，etal.Nucleotide sequence of a bovineclone encoding the angiogenic protein，baesic fibroblast growth factor［J］.Science，1986，233：545.

［2］ 張?zhí)N慧.復方桑仙顆粒治療中老年高血壓病的臨床和實驗研究［D］.濟南：山東中醫(yī)藥大學博士學位論文，2001.

［3］ 駱秉銓，韓冰，林榮，等.高血壓病人阻力動脈重構(gòu)和微血管功能障礙［J］.中國微循環(huán)，2005，9（6）：414－416.

［4］ 吳平生，米倉秀人，山本博.血管新生抑制基因在微血管內(nèi)皮細胞及周皮細胞中的表達及其低氧的影響和機制［J］.嶺南心血管病雜志，2000，6（4）：274.

［5］ 劉承基.腦血管外科學［M］.第2版.南京：江蘇科學技術(shù)出版社，2000：1－5.

［6］ 李剛，柴琳.內(nèi)皮抑素（Endostatin）研究進展［J］.皖南醫(yī)學院學報，2010，29（2）：156－158.

［7］ Abdollah IA，Hahnfeld TP，Maercke RC，etal.Endostatins antiangiogenic signaling network［J］.Mol Cell，2004，13（5）：649－663.

［8］ Nybergp，Heikkila P，Sorsat，etal.Endostatininhibits human tongue carcinoma cell invasion and intravasation and blocksthe activation of matrix metalloprotease－2，－9，and－13［J］.J Biol Chem，2003，278（25）：22404－22411.