周瑤 ，王穎 ，安宇 ，姚笛 ，張紅

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科技學(xué)院）

細(xì)菌素，是通常由質(zhì)粒編碼的某些細(xì)菌分泌的肽抗生素，吸附于敏感菌細(xì)胞的表面特異受體。這種短肽是先天免疫的重要防御物質(zhì)，其作用機(jī)制或是通道形成穿膜蛋白，使膜去極化；或是DNA酶或RNA酶的抑制劑。其具有廣譜抗菌活性和抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲及抗腫瘤等生物活性，且不易產(chǎn)生抗藥性，是生物天然的、非特異性防御系統(tǒng)的重要組成部分[1]。但這類拮抗物在分子量、理化特征、敏感度及作用途徑差異很大。國外對乳酸菌素的研究較早，目前最徹底、應(yīng)用最廣的細(xì)菌素當(dāng)屬由各種乳酸乳球菌產(chǎn)生的乳鏈菌肽（Nisin），是唯一被允許作為防腐劑在食品中使用的[2]；國內(nèi)對乳酸菌素的研究起始于1980年末，中科院微生物所率先分離和篩選出產(chǎn)生Nisin Z的乳酸鏈球菌菌株，抑菌譜更加廣泛。據(jù)報(bào)道，奶酪中的細(xì)菌素對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌等病原菌均有強(qiáng)烈的抑制作用[3]，所以對奶酪中產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的生理生化特性研究有著深遠(yuǎn)的社會(huì)與經(jīng)濟(jì)意義。本文對內(nèi)蒙古奶酪中分泌細(xì)菌素的乳酸桿菌進(jìn)行傳統(tǒng)的微生物方法的分離和鑒定。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪（市場購買）。

指示菌：金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌、單增李斯特桿菌、志賀（氏）、銅綠假單孢桿菌、蠟樣桿菌、黑曲霉、青霉（實(shí)驗(yàn)室保存）；抑菌活性指示菌為單核細(xì)胞增生李斯特菌和致病性大腸桿菌。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

蛋白酶K和H2O2酶（廣州杰諾生物酶公司）；碳酸鈣、檸檬酸銨、NaCl和葡萄糖（天津大茂化學(xué)試劑廠）；MRS培養(yǎng)基、蛋白胨培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

生化培養(yǎng)箱、電熱恒溫水鍋、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱和臺式多管架離心機(jī)（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），pH計(jì)和電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 分離產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌

1.2.1.1 制備奶酪發(fā)酵液

將內(nèi)蒙古奶酪和生理鹽水按照1∶50的比例在25℃下震蕩培養(yǎng)24 h，活化3次，取最后一次備用。吸取梯度稀釋至10-5的發(fā)酵液1mL，均勻涂布在MRS培養(yǎng)基上，37℃下培養(yǎng)72 h。挑取優(yōu)勢菌落培養(yǎng)，染色鏡檢觀察，確定菌落形態(tài)和特征[4]。

1.2.1.2 發(fā)酵代謝物的鑒定

細(xì)菌素抗菌活性的檢測采用牛津杯法[5]。

（1）有機(jī)酸的排除實(shí)驗(yàn) 為了排除發(fā)酵液代謝過程中產(chǎn)生的乳酸、乙酸等有機(jī)酸的干擾，將培養(yǎng)好的發(fā)酵液離心后獲得無細(xì)胞發(fā)酵上清液，將此上清液的pH值調(diào)為5.0與發(fā)酵液相同pH值的乳酸、乙酸為對照，采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法測定抑菌活性，結(jié)果見表1。

（2）H2O2的排除實(shí)驗(yàn) 取分離菌發(fā)酵液0.5mL，加入 9 mg·mL-1H2O2酶 0.5mL，35 ℃處理 1.5 h，以未處理的發(fā)酵液為對照，測定抑菌活性的變化情況。

（3）蛋白類抑菌物質(zhì)的確定 將產(chǎn)細(xì)菌素菌株的無細(xì)胞發(fā)酵液pH值調(diào)至中性后，按1 mg·mL-1加入蛋白酶K混勻，37℃反應(yīng)3 h然后與未經(jīng)處理的發(fā)酵液（對照）一起做抑菌實(shí)驗(yàn)，測定抑菌活性的變化情況。

1.2.2 鑒定產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌的抑菌效果

1.2.2.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌發(fā)酵液的制備

離心處理發(fā)酵液，3000 rpm 15min，取上清備用。排除有機(jī)酸和H2O2的干擾加入60%（NH4）2SO4鹽析，4℃沉淀12 h后，5000 rpm 20min，用原體積1/10的蒸餾水溶解蛋白質(zhì)沉淀制成發(fā)酵液。

1.2.2.2 確定發(fā)酵物的抑菌譜

取發(fā)酵上清液，采用牛津杯法對指示菌做抑菌實(shí)驗(yàn)。利用平板劃線2%CaCO3的MRS瓊脂培養(yǎng)基，從奶酪發(fā)酵液中分離得到G+，接觸酶陰性的，并使石蕊牛奶凝乳的乳酸菌4株，以大腸桿菌和單核細(xì)胞假單增生李斯特作為敏感指示菌，經(jīng)紙片法測定4株疑似菌株的抑菌結(jié)果見圖1和2。由圖可知G2菌株的抑菌活性較高，所以只選用G2分別測定對嗜熱鏈球菌、大腸桿菌、單細(xì)胞增生李斯特菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、費(fèi)氏志賀氏菌（微生物實(shí)驗(yàn)室保藏，分別標(biāo)示為1～6）的抑菌活性，結(jié)果見圖3。

1.2.3 測定分離菌株的生理生化特性

對分離到的菌株進(jìn)行常規(guī)的生理生化特性的測定以及溫度適應(yīng)性和耐鹽性的確定[6-9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌效果的鑒定

由圖1和2可知G2菌株的抑菌活性較高，所以只選用G2分別測定對6種指示菌的抑菌活性，結(jié)果顯示G2對單細(xì)胞增生李斯特菌最敏感，然后為金黃色葡萄球菌，對嗜熱鏈球菌、大腸桿菌和費(fèi)氏志賀氏菌敏感度相當(dāng)，對枯草芽孢桿菌最不敏感。

圖1 G2菌對大腸桿菌的抑菌效果Fig.1 The antibacterial result of G2 to E coli

圖2 G2菌對單增李斯特菌的抑菌效果Fig.2 The antibacterial result of G2 to Mono Listeria

圖3 G2對六種菌的抑菌活性Fig.3 The antibacterial activity of G2 to six kinds of bacteria

2.2 分離菌的形態(tài)及初步鑒定

2.2.1 發(fā)酵菌株的形態(tài)確定

在MRS平板上培養(yǎng)48 h后菌落特征和菌體形態(tài)（圖4和圖5）。菌落直徑1～3 mm，不形成孢子。菌體卵球形，單個(gè)，成對或無鞭毛，圓形乳白色，表面光滑。短鏈狀，不運(yùn)動(dòng)，G+。

圖4 G2菌株的菌體特征（10×100倍）Fig.4 The Bacterial characteristics of G2

圖5 G2的菌落形態(tài)Fig.5 The colonial morphology of G2

2.2.2 發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的確定

采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法測定抑菌活性的結(jié)果見表1。由表1可知，同為pH值5.0的乳酸和乙酸對大腸桿菌和單增李斯特菌無抑制作用，而奶酪發(fā)酵液抑制作用顯著，可推斷抑菌效果與有機(jī)酸無關(guān)。另一方面，H2O2是乳酸菌的代謝副產(chǎn)物，也可抑制微生物的生長發(fā)育，添加H2O2酶可以消除H2O2的抑制作用，結(jié)果顯示與H2O2無直接相關(guān)性。最后，按1 mg·mL-1的濃度在調(diào)至中性的產(chǎn)細(xì)菌素菌株的無細(xì)胞發(fā)酵液中加入蛋白酶K，攪拌均勻后38℃反應(yīng)3 h，陰性發(fā)酵液對照做抑菌實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明蛋白酶K處理的菌株發(fā)酵液，抑菌活性下降顯著，證明其抑菌作用的主要成分是蛋白質(zhì)類。

表1 不同處理對抑菌活性的影響Table 1 Effect of different treatment on antibacterial activity

2.3 細(xì)菌素抑菌譜的確定

細(xì)菌素抑菌譜結(jié)果如表2，可以看出分離菌株所產(chǎn)細(xì)菌素對酵母和霉菌沒有抑制作用，對其他污染菌均有不同程度的抑制作用。

表2 G2菌株抑菌譜測定結(jié)果Table 2 The antibacterial spectrum of the separated strains

2.4 分離菌菌種的生理生化鑒定

綜合形態(tài)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定[6]，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》及《乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[7-8]，進(jìn)一步判斷其為保加利亞乳桿菌。

表3 G2菌株生理生化鑒定結(jié)果Table 3 The biochemical identification results of Lactic acid bacteria G2 strain

3 結(jié)論

鑒定菌種程序中傳統(tǒng)的理化試驗(yàn)是基本，本試驗(yàn)即基于常規(guī)抗菌譜測定、菌落形態(tài)與特征和生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定等方法，從內(nèi)蒙古奶酪中分離的1株乳酸桿菌。鑒于每一種細(xì)菌的種內(nèi)和株間也可能存在性狀和生化反應(yīng)的突變和特異，緊靠表型試驗(yàn)的常規(guī)技術(shù)對菌株做出準(zhǔn)確的鑒定的方法也可能存在缺陷和不足，所以本實(shí)驗(yàn)的抑菌活性的測定中，采用多種方法相結(jié)合來確定細(xì)菌素的主要成分，基本能夠確定分泌的細(xì)菌素是蛋白質(zhì)。

關(guān)于細(xì)菌素的理化特征的深入研究，對碳源、氮源、無機(jī)鹽等培養(yǎng)基主要成分對細(xì)菌素產(chǎn)量的影響的觀測不能忽視，同時(shí)應(yīng)該結(jié)合對新發(fā)現(xiàn)菌株和原產(chǎn)于誘變后的高產(chǎn)菌株的進(jìn)一步篩選與鑒定，另外，對于已知細(xì)菌素遺傳基因、結(jié)構(gòu)基因和功能基因的鑒定與克隆，進(jìn)而對乳酸菌分泌的細(xì)菌素在遺傳特性及功能調(diào)控等繼續(xù)深入，對于推廣其廣闊的應(yīng)用前景具有積極的作用。

［1］劉慧，李平蘭，高秀芝，等.開菲爾粒中乳酸菌的分離方法研究［J］.食品科學(xué)，2007（6）：56-60.

［2］Hechard Y，Sahl H.G.Mode of action ofmodified and unmoditied bacteriocins from Grampositive bacteria［J].Biochimie，2007，84:545-557.

［3］Koji Yamazaki，minako Suzuki. Purification and Characterazation of a Novel Class Ⅱa Bacteriocin，Piscicocin CS526，from Surimi-Associated Carnobacterium piscicola CS526 ［J］. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（1）:554-557.

［4］Gill A O，Holey R A.Interactive inhibition of meat spoilage and pathogenic bacteria by lysozyme of Food［J］.Microbiology，2003，80:251-259.

［5］Branen J K，Davidson P M.Enhancement of Nisin，lysozyme and monolaurin antimicrobial activities by ethylene diamine tetraacetic acid and lactoferrin ［J］.International Journal of Food Microbiology，2004，90:63-74.

［6］王穎，桑文彥，安宇.開菲爾粒中產(chǎn)球菌樣細(xì)菌素乳酸菌的分離與鑒定［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2011,23（5）：50-53.

［7］郭本恒.乳品微生物學(xué)［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2001.

［8］Antonio Maldonado，Jose Luis Ruiz-Barba.Purification and Genetic Characterazation ofPlantarcin NC8，a Novel Coculture-Inducible Two-Peptide Bacteriocion from Lactobacillus plantarum NC8 ［J］. Applied and Environmental Microbiology，2003，69（1）:383-389.