代，郭和蓉，張興龍，李強(qiáng)

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州510642）

目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)燃料酒精的原料主要有玉米（Zeamays）（美國(guó)）［1］、甘蔗（Saccharumofficinarum）（巴西）［2］、薯類、谷類等，考慮到糧食短缺、人口壓力等問題，尋找一種新的燃料酒精的生產(chǎn)底物勢(shì)在必行。纖維質(zhì)原料具有來源廣泛、成本低廉、可再生等優(yōu)點(diǎn)［3］，因此被看作是最具價(jià)值的生產(chǎn)燃料酒精的潛在資源，以將纖維素為原料轉(zhuǎn)化為燃料酒精最具現(xiàn)實(shí)意義。在纖維素燃料酒精轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)和研究方面，巴西和美國(guó)走在了世界的前列［4］。巴西開發(fā)了以甘蔗渣為原料制酒精的新技術(shù)（迪丁尼快速水解法，DHR），減少水解蔗渣的時(shí)間而獲得高的轉(zhuǎn)化率［5］；美國(guó)也進(jìn)行了“纖維素水解與發(fā)酵同步”及木質(zhì)纖維素“溶解性分離”等一系列研究工作［6］，但以纖維素制乙醇的工業(yè)規(guī)模技術(shù)一直未達(dá)到成熟［7］。此外，加拿大Iogen公司在纖維乙醇技術(shù)開發(fā)，尤其是纖維素酶技術(shù)開發(fā)方面居世界領(lǐng)先地位［8］；德國(guó)產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所進(jìn)行發(fā)酵液中乙醇的膜分離技術(shù)的開發(fā)；日本也建立了較完善的與纖維素燃料乙醇相關(guān)的研發(fā)體系［5］。

我國(guó)在纖維素酒精生產(chǎn)和技術(shù)開發(fā)上也取得了一些重要進(jìn)展。中糧集團(tuán)在黑龍江肇東建立了年產(chǎn)500t的纖維素乙醇中試裝置，并已經(jīng)擁有36項(xiàng)燃料酒精方面的專利，其中，與纖維素酒精相關(guān)的有14項(xiàng)；2008年5月8日，河南天冠集團(tuán)研制建成了中國(guó)首條年產(chǎn)5 000t纖維酒精項(xiàng)目產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)線，并且順利產(chǎn)出了第一批纖維酒精［6］。中國(guó)科學(xué)院過程工程所已在山東建立了年產(chǎn)3 000t的纖維乙醇示范工程；吉林燃料乙醇有限公司已和華東理工大學(xué)就建立年產(chǎn)3 000t纖維乙醇的合作達(dá)成協(xié)議，并啟動(dòng)了項(xiàng)目實(shí)施［8］。除此之外，我國(guó)也進(jìn)行了“利用農(nóng)業(yè)纖維廢棄物代替糧食生產(chǎn)酒精”，玉米秸稈間歇蒸汽爆破預(yù)處理、纖維素酶水解和戊糖己糖同步發(fā)酵技術(shù)制取纖維乙醇中試裝置等一系列研究工作［6］。

一年生黑麥草（Loliummultiflorum）是禾本科黑麥草屬植物，生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)量高［9］，易種植，好管理［10］，是我國(guó)南方廣泛栽培的優(yōu)良牧草［11］。目前，可作為能源植物發(fā)展的植物種類豐富，如甘蔗［12］渣、麥（Triticumaestivum）稈［13］、柳枝稷（Panicumvirgatum）［14，15］等。它們的木質(zhì)素含量［16－18］均比一年生黑麥草高，而它們的纖維素和半纖維素含量［16－18］與一年生黑麥草卻有著極大的相似性。另外，一年生黑麥草纖維構(gòu)成適合于酒精的轉(zhuǎn)化，所以具有較大的研究和開發(fā)價(jià)值。有研究表明黑麥草已經(jīng)被應(yīng)用到發(fā)酵等工業(yè)領(lǐng)域，將其經(jīng)過預(yù)處理及纖維素、半纖維素酶解后，對(duì)探索生物酒精的制備有重要意義［19］。本試驗(yàn)采用2種發(fā)酵方案，研究利用一年生黑麥草發(fā)酵處理制取酒精，通過對(duì)影響因素的優(yōu)化，得出最佳發(fā)酵體系，為再生能源的開發(fā)尋找到一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2008－2009年在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院進(jìn)行，以分別經(jīng)過酸預(yù)處理［在溫度120℃條件下，粒度18～35目（0.425～0.880mm）的邦德以8∶1液固比經(jīng)1%H2SO4處理2h］和堿預(yù)處理［在溫度100℃條件下，粒度18～35目（0.425～0.880mm）的邦德以6∶1液固比經(jīng)10%NaOH 處理2h］，再用綠色木酶（Trichoderma viride）酶解72h后的一年生黑麥草邦德（L.multiflorumcv.Abundant）為材料。

1.2 發(fā)酵單因素試驗(yàn)

經(jīng)過酶解后的酸堿預(yù)處理材料在發(fā)酵階段主要采取2種方案，酵母組合均為普通釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，產(chǎn)品代碼CICC1001）＋畢赤酵母（Pichiapastoris）。方案1：預(yù)處理材料＋酵母組合，體積比約為7∶3；方案2：預(yù)處理材料＋酵母組合＋黑曲霉（Aspergullusniger，產(chǎn)品代碼AS 3.877），體積比約為7∶3∶2。所有微生物均由廣州微生物所提供。發(fā)酵處理的具體方法見表1，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，測(cè)定指標(biāo)為酒精度、原料酒精轉(zhuǎn)化率。

1.3 發(fā)酵正交試驗(yàn)

為進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵的工藝條件和研究各因素對(duì)發(fā)酵影響的主次順序，采用正交試驗(yàn)研究了發(fā)酵溫度、時(shí)間和菌株濃度對(duì)預(yù)處理的影響，其中酸堿預(yù)處理的pH均是5.5，其余各因素水平是在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選定的，測(cè)定指標(biāo)及試驗(yàn)重復(fù)次數(shù)同單因素試驗(yàn)，試驗(yàn)條件見表2。

1.4 發(fā)酵方法

將酸堿預(yù)處理＋酶解后的材料放在250mL三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，每瓶裝酸（堿）預(yù)處理液體（中和后，全部加入）、（NH4）HPO4（0.25g／L）、MgSO4·7H2O（0.025g／L）共100mL。滅菌后置恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)振蕩培養(yǎng)，控制溫度31～43℃。按發(fā)酵液體積的8%～14%接種菌株。

表1 酸堿預(yù)處理材料酶解后的發(fā)酵單因素試驗(yàn)Table 1 Range of factors in fermentation single－factor test based on pretreatment with H2SO4（NaOH）and enzymatic hydrolysis

表2 硫酸（氫氧化鈉）預(yù)處理材料酶解后的發(fā)酵正交試驗(yàn)Table 2 Range of factors in fermentation orthogonal test based on pretreatment with H2SO4（NaOH）and enzymatic hydrolysis

1.5 測(cè)定指標(biāo)

1.5.1 酒精度 發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液置于蒸餾瓶中，緩緩加熱蒸餾，收集約96mL餾出液，定容至100mL容量瓶，調(diào)溫至20℃。用25mL附溫度計(jì)密度瓶測(cè)試樣餾出液20℃的相對(duì)密度，附溫度計(jì)比重瓶（整套）先用蒸餾水清洗干凈，再用乙醇、乙醚清洗干凈，稱得自重，計(jì)G1；蒸餾水煮沸30min冷卻至15℃注滿瓶中，裝上溫度計(jì)（注意排空瓶中氣體），浸入（20±1）℃的恒溫水浴鍋中，至比重瓶溫度穩(wěn)定到20～30℃，用濾紙吸去側(cè)管之水，蓋上小罩，取出擦干，稱得瓶（整套）和水之重，計(jì)G3；重復(fù)上一步驟測(cè)定待測(cè)液體，稱得瓶（整套）和待測(cè)液之重，計(jì)G2；酒精相對(duì)密度（20℃）計(jì)算公式：Y＝（G2－G1）×0.998 23／（G3－G1），根據(jù)相對(duì)密度查表，得到試樣的酒精度（Q）。酒精相對(duì)密度見文獻(xiàn)［20］。

1.5.2 原料酒精轉(zhuǎn)化率 原料酒精轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式

式中，y表示原材料酒精轉(zhuǎn)化率（%，w／w），Q表示酒精度（%，V／V），V（mL）是蒸餾液體積，0.8（g／mL）是酒精密度，25.00（g）表示原材料質(zhì)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS 8.1和Excel 2003進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度的影響

2種發(fā)酵處理的酒精度隨著溫度的升高均呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)（圖1）。酸預(yù)處理＋酶解和堿預(yù)處理＋酶解材料的2種發(fā)酵處理的酒精度均在37℃時(shí)達(dá)到最大值，分別為2.3%，2.5%和2.1%，2.5%。酵母組合＋黑曲霉處理的酒精度略高于酵母組合處理，差異不顯著，說明黑曲霉起到了同步降解纖維素的作用。37℃是比較理想的發(fā)酵溫度。

2.2 發(fā)酵時(shí)間的影響

2種發(fā)酵處理的酒精度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)出先增加后基本保持不變的趨勢(shì)（圖2）。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在36h左右時(shí)，酸預(yù)處理＋酶解材料的2種發(fā)酵處理的酒精度比較接近，而堿預(yù)處理＋酶解材料的2種發(fā)酵處理的酒精度卻相差較大，但二者差值卻相對(duì)恒定，表現(xiàn)為隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，絕對(duì)差值變幅不大。酸預(yù)處理＋酶解和堿預(yù)處理＋酶解材料的2種發(fā)酵處理的酒精度分別在36～48和48～60h時(shí)達(dá)到最大值，分別為2.3%，2.5%和2.1%，2.4%。酵母組合＋黑曲霉處理的酒精度略高于酵母組合處理，差異不顯著。結(jié)合發(fā)酵數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵時(shí)間超過48h后，酒精度的增加幅度接近于0或者出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，這可能與微生物自身消耗有一定的關(guān)系，綜合考慮認(rèn)為48h是相對(duì)最優(yōu)的發(fā)酵時(shí)間。

圖1 不同發(fā)酵溫度下的酒精度比較Fig.1 Comparison of the alcohol content at different fermentation temperatures

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間下的酒精度比較Fig.2 Comparison of the alcohol content at different fermentation time

2.3 發(fā)酵液pH值的影響

2種發(fā)酵處理的酒精度隨著pH的升高均呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)（圖3）。酸預(yù)處理＋酶解材料的2種發(fā)酵處理的酒精度范圍分別是1.4%～2.3%和1.5%～2.5%，堿預(yù)處理＋酶解材料的2種發(fā)酵處理的酒精度范圍分別是1.4%～2.1%和1.6%～2.5%，且均在pH為5.5時(shí)達(dá)到最大值，酵母組合＋黑曲霉處理的酒精度略高于酵母組合處理，差異不顯著。

2.4 菌株濃度的影響

2種發(fā)酵處理的酒精度隨著菌株濃度的升高均呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)（圖4）。酵母組合＋黑曲霉處理的酒精度高于酵母組合處理，說明黑曲霉起到了同步降解纖維素的作用。

在不同菌株濃度下，酵母組合處理的酒精度范圍分別是1.9%～2.3%和1.7%～2.3%，酵母組合＋黑曲霉處理的酒精度范圍分別是2.1%～2.5%和2.1%～2.3%。兩種發(fā)酵處理的酒精度在菌株濃度分別為10%、12%時(shí)達(dá)到最大值。

圖3 不同pH值下的酒精度比較Fig.3 Comparison of the alcohol content at different pH values

圖4 不同菌株濃度下的酒精度比較Fig.4 Comparison of the alcohol content at different concentrations of strains

2.5 發(fā)酵正交試驗(yàn)分析

2.5.1 原料酒精轉(zhuǎn)化率變化趨勢(shì) 2種發(fā)酵方案的原料酒精轉(zhuǎn)化率隨著溫度的升高均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)（圖5，6），隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，原料酒精轉(zhuǎn)化率表現(xiàn)出先有所增加后維持穩(wěn)定的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過48 h以后，原料酒精轉(zhuǎn)化率變化幅度不大，時(shí)間過長(zhǎng)還會(huì)導(dǎo)致原料酒精轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)。

酸（堿）預(yù)處理＋酶解后的材料在發(fā)酵階段，隨著菌株濃度的增加呈拋物線形狀（圖7），即在菌株濃度達(dá)到一定程度時(shí)，菌株濃度的增加會(huì)降低原料酒精轉(zhuǎn)化率，這與微生物自身的消耗有關(guān)。隨著發(fā)酵溫度的增加、發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)、菌株濃度的增加，原料酒精轉(zhuǎn)化率均呈先增加后降低的趨勢(shì)。

由圖5～7可以得出合適的發(fā)酵溫度、適中的發(fā)酵時(shí)間與適宜的菌株濃度均有利于原料酒精轉(zhuǎn)化率的提高，與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.5.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析 酸預(yù)處理＋酶解＋酵母組合的酒精度與原料酒精轉(zhuǎn)化率影響因素主次順序相同（表3，4），均為菌株濃度＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間；酸（堿）預(yù)處理＋酶解＋酵母組合＋黑曲霉和堿預(yù)處理＋酶解＋酵母組合3種處理方式的酒精度與原料酒精轉(zhuǎn)化率影響因素主次順序均相同，均為發(fā)酵溫度＞菌株濃度＞發(fā)酵時(shí)間。

酸預(yù)處理＋酶解＋酵母組合正交試驗(yàn)的最優(yōu)水平組合相同，均為D2E2F2，即發(fā)酵溫度37℃，菌株濃度10%，發(fā)酵時(shí)間48h；酸預(yù)處理＋酶解＋酵母組合＋黑曲霉正交試驗(yàn)的最優(yōu)水平組合相同，均為D2E3F1，即溫度37℃，菌株濃度14%，發(fā)酵時(shí)間36h（表4）。整體上對(duì)于酸預(yù)處理＋酶解的材料而言，2種發(fā)酵方案的相對(duì)最優(yōu)發(fā)酵溫度均為37℃，但相對(duì)最優(yōu)菌株濃度和發(fā)酵時(shí)間均不一致。結(jié)合單因素試驗(yàn)和極差值可以得出，隨著菌株濃度的提高，原料酒精轉(zhuǎn)化率的提高幅度不明顯，但至于是否會(huì)縮短發(fā)酵時(shí)間還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。綜合考慮認(rèn)為菌株濃度12%，發(fā)酵時(shí)間48h是相對(duì)最優(yōu)的選擇。

圖5 原料酒精轉(zhuǎn)化率隨溫度提高的變化趨勢(shì)Fig.5 The trend of alcohol conversion rate of raw materials with the temperature increase

圖6 原料酒精轉(zhuǎn)化率隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)的變化趨勢(shì)Fig.6 The trend of alcohol conversion rate of raw materials with the extension of fermentation time

圖7 原料酒精轉(zhuǎn)化率隨菌株濃度增加的變化趨勢(shì)Fig.7 The trend of alcohol conversion rate of raw materials with the concentrations of strains increase

表3 酸堿預(yù)處理邦德酶解后發(fā)酵的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the fermentation orthogonal design on Abundant based on pretreatment with H2SO4（NaOH）and enzymatic hydrolysis%

表4 酸堿預(yù)處理邦德酶解后發(fā)酵的正交試驗(yàn)極差分析Table 4 The range analysis method of the fermentation orthogonal experiment on Abundant based on pretreatment with H2SO4（NaOH）and enzymatic hydrolysis

堿預(yù)處理＋酶解＋酵母組合正交試驗(yàn)的最優(yōu)水平組合分別為D2E2F2和D2E2F3，即相對(duì)最優(yōu)發(fā)酵溫度和菌株濃度均一致，分別為37℃和10%，相對(duì)最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間不一致。堿預(yù)處理＋酶解＋酵母組合＋黑曲霉正交試驗(yàn)的最優(yōu)水平組合分別為D2E2F2和D2E2F3，即相對(duì)最優(yōu)溫度和菌株濃度均一致，分別為37℃和12%，相對(duì)最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間不一致。結(jié)合單因素試驗(yàn)和極差值可以得出，發(fā)酵時(shí)間在超過48h后，原料酒精轉(zhuǎn)化率變化幅度不大，時(shí)間過長(zhǎng)還會(huì)導(dǎo)致原料酒精轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)。整體上對(duì)于堿預(yù)處理＋酶解的材料而言，2種發(fā)酵方案的相對(duì)最優(yōu)發(fā)酵溫度均為37℃，相對(duì)最優(yōu)菌株濃度分別為10%和12%，相對(duì)最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間均為48h。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)主要針對(duì)普通酵母、畢赤酵母、黑曲霉進(jìn)行了一些探索。通過預(yù)處理后，方案1（普通酵母＋畢赤酵母，體積比7∶3）的相對(duì)最優(yōu)發(fā)酵條件為：溫度37℃，菌株濃度10%，pH 5.5，時(shí)間48h。在此條件下，酸堿預(yù)處理＋酶解后發(fā)酵的酒精度分別為2.2%和2.1%。方案2（普通酵母＋畢赤酵母＋黑曲霉，體積比7∶3∶2）的相對(duì)最優(yōu)發(fā)酵條件為：溫度37℃，菌株濃度12%，pH 5.5，時(shí)間48h。在此條件下，酸堿預(yù)處理＋酶解后發(fā)酵的酒精度分別為2.3%和2.5%。

酸堿預(yù)處理＋酶解后的材料采用發(fā)酵方案2的原料酒精轉(zhuǎn)化率相對(duì)較高，分別為8.36%和8.39%。2種方案的原料酒精轉(zhuǎn)化率隨著發(fā)酵溫度的增加、發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)、菌株濃度的增加，均呈先增加后降低的趨勢(shì)。綜合分析可以得出，2種處理方式的酒精度均為2.2%左右，原料酒精轉(zhuǎn)化率均約8.0%，差異不顯著，和安宏［21］的纖維素發(fā)酵結(jié)果13.6%、李文亮等［22］的甜高粱（Sorghumvulgare）發(fā)酵結(jié)果14.2%相比，轉(zhuǎn)化率相對(duì)較低，說明要在后續(xù)研究中深入分析酸堿預(yù)處理的特點(diǎn)及預(yù)處理后的物質(zhì)組成，進(jìn)而為發(fā)酵菌種的馴化和選擇奠定基礎(chǔ)。另外，本試驗(yàn)是在搖瓶條件下進(jìn)行的，在種子液培養(yǎng)過程中，菌種接入較大，所以實(shí)際酒精轉(zhuǎn)化率可能要略小于上述值，離工業(yè)應(yīng)用要求還有很大的差距，還需要進(jìn)一步的探索研究。

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