徐開杰，燕明獻(xiàn)，柴乖強(qiáng)，孫風(fēng)麗，劉曙東，奚亞軍

（西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌712100）

柳枝稷（Panicum virgatum），屬于禾本科（Gramineae）黍?qū)伲≒anicum），是起源于北美洛基山脈以東、北緯55°以南大草原的高稈多年生草本C4植物，通常被用于放牧、水土保持以及生態(tài)建設(shè)等［1，2］。近幾年來隨著社會(huì)的發(fā)展，人類對(duì)能源的需求日益劇增，而全球化石原料的不可再生性以及其對(duì)環(huán)境造成的嚴(yán)重污染，使尋找一種新的可再生清潔能源成為世界各國研究的當(dāng)務(wù)之急。柳枝稷因其適應(yīng)性強(qiáng)，生物量潛力高和耐旱耐貧瘠能力較強(qiáng)，對(duì)環(huán)境友好，能夠用于生產(chǎn)生物能源等優(yōu)點(diǎn)引起了國內(nèi)外的重視［3－5］。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已成為一種最常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法，在植物遺傳改良方面展示出廣闊地應(yīng)用前景，在多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物中實(shí)現(xiàn)了較為高效的轉(zhuǎn)化［6－8］。與其他轉(zhuǎn)化方法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)具有轉(zhuǎn)化的外源DNA結(jié)構(gòu)完整、遺傳穩(wěn)定、拷貝數(shù)低、轉(zhuǎn)化的DNA片段較大等優(yōu)點(diǎn)，已成為目前大多數(shù)植物遺傳轉(zhuǎn)化的首選方法［9－12］。

柳枝稷的遺傳轉(zhuǎn)化研究起步較晚，迄今為止國內(nèi)外對(duì)柳枝稷農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因研究尚處于體系建立的探索階段［13－16］。農(nóng)桿菌常規(guī)介導(dǎo)法對(duì)組織培養(yǎng)技術(shù)依賴性強(qiáng)，對(duì)組織培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格，農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）浸染過的愈傷組織在培養(yǎng)過程中受剩余農(nóng)桿菌難以抑制、抗生素篩選等因素的影響而長勢較弱、缺乏生長點(diǎn)甚至大量死亡等特殊問題，使得傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在柳枝稷上受到了一定限制。

農(nóng)桿菌浸種法是將萌動(dòng)種子直接浸泡在農(nóng)桿菌菌液中，利用農(nóng)桿菌的浸染特性和植物細(xì)胞自身的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)把外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞并整合到基因組中穩(wěn)定表達(dá)，通過種子天然的遺傳傳遞能力，實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化［17］。這種方法操作簡單，避免了常規(guī)介導(dǎo)法存在的一系列弊端。1987年，F(xiàn)eldmann和Marks［18］首次報(bào)道應(yīng)用農(nóng)桿菌浸種法在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中取得成功，繼而應(yīng)用該法在小麥（Triticum aestivum）、黃瓜（Cucumis sativus）和番茄（Solanum lycopersicum）等作物中也取得成功［17，19－21］。

本試驗(yàn)以‘西稷1號(hào)’、‘西稷2號(hào)’和‘西稷3號(hào)’3個(gè)基因型的柳枝稷種子作為研究對(duì)象，通過分析農(nóng)桿菌浸種后柳枝稷種子萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育的相關(guān)指標(biāo)，確定不同濃度農(nóng)桿菌對(duì)柳枝稷種子萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育的影響，以期為柳枝稷農(nóng)桿菌浸種法遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥和柳枝稷分子育種實(shí)驗(yàn)室選育的3個(gè)柳枝稷品系‘西稷1號(hào)’、‘西稷2號(hào)’和‘西稷3號(hào)’為試驗(yàn)材料，農(nóng)桿菌菌株為本實(shí)驗(yàn)室提供的EHA105，試驗(yàn)于2011年4－6月在西北農(nóng)林科技大學(xué)溫室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 種子預(yù)處理 取成熟飽滿的柳枝稷種子，70%的酒精表面消毒，用20%的NaClO滅菌15～20min，無菌水沖洗3～4次，室溫?zé)o菌水浸種12h，4℃過夜，然后濾干水分24℃暗培養(yǎng)至種子露白。

1.2.2 農(nóng)桿菌準(zhǔn)備 用LB（Luria－Bertani）固體培養(yǎng)基劃線接種農(nóng)桿菌，28℃靜置暗培養(yǎng)2～3d。刮出單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中，28℃、220r／min振蕩培養(yǎng)24h，分光光度計(jì)（725N，上海棱光）在波長為600nm的吸光度測定菌液OD600值。

1.2.3 農(nóng)桿菌浸種 試驗(yàn)采用裂區(qū)設(shè)計(jì)，以柳枝稷不同品系為主區(qū)，農(nóng)桿菌菌液濃度為副區(qū)。其中農(nóng)桿菌菌液濃度梯度設(shè)置為CK（以未加農(nóng)桿菌的LB培養(yǎng)基為對(duì)照），0.4，0.8，1.2和1.6OD600共5個(gè)水平，將預(yù)處理露白的柳枝稷種子利用農(nóng)桿菌浸種4h后倒掉菌液，用無菌水沖洗干凈，于24℃黑暗條件下共培養(yǎng)2d，然后轉(zhuǎn)入光照條件下，1周后待幼苗根長2cm左右，轉(zhuǎn)移到溫室盆栽，取大田土過篩裝盆，每盆12株，試驗(yàn)溫室盆栽管理?xiàng)l件是在25℃，光照強(qiáng)度12 000lx，光照時(shí)間14h／d，每隔3d澆1次水，7d施1次肥，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 測定項(xiàng)目與方法 農(nóng)桿菌浸種后第7天測定發(fā)芽率（盆栽前），盆栽第3周幼苗三葉期取其葉片測定其余指標(biāo)。

幼苗總?cè)~綠素含量用丙酮法測量［22］；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、過氧化物酶（peroxidase，POD）活性、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量具體參照孫群和胡景江［23］的方法測定，每指標(biāo)均重復(fù)測定3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS裂區(qū)設(shè)計(jì)中的LSD檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)桿菌不同菌液濃度對(duì)柳枝稷種子發(fā)芽率的影響

農(nóng)桿菌對(duì)柳枝稷不同品系發(fā)芽率的影響大致相同。在菌液濃度≤1.2OD600時(shí)，種子發(fā)芽率隨菌液濃度的增大呈下降趨勢，在1.2OD600時(shí)，發(fā)芽率達(dá)到最低值，此后略有升高（圖1）。方差分析表明，品系與濃度間的互作效應(yīng)不顯著。品系間西稷1號(hào)與西稷3號(hào)的發(fā)芽率差異不顯著，而兩者極顯著高于西稷2號(hào)（P＜0.01）。在一定菌液濃度范圍內(nèi)（≤1.2OD600），柳枝稷種子發(fā)芽率隨著農(nóng)桿菌菌液濃度增加而顯著降低，各處理與對(duì)照間差異均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。但當(dāng)菌液濃度高于1.2OD600后，柳枝稷種子發(fā)芽率不再降低，且有一定程度回升。

2.2 農(nóng)桿菌不同菌液濃度對(duì)柳枝稷幼苗成苗率的影響

農(nóng)桿菌浸種不僅能抑制種子的萌發(fā)，也影響柳枝稷幼苗的成苗率（圖2）。柳枝稷幼苗的成苗率隨著菌液濃度的升高總體呈下降趨勢。在農(nóng)桿菌菌液濃度較低時(shí)，成苗率較高，當(dāng)菌液濃度為1.6OD600時(shí)，3個(gè)材料的幼苗成苗率均達(dá)到或接近最小值，分別為22.73%，18.01%和42.15%，其成苗率均低于50%。方差分析表明，品系與濃度間互作效應(yīng)不顯著。品系間表現(xiàn)為西稷3號(hào)＞西稷1號(hào)＞西稷2號(hào)，各品系間差異均達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。在菌液濃度≤0.8OD600時(shí)，幼苗成苗率呈下降趨勢，且各處理間的幼苗成苗率差異極顯著（P＜0.01）；菌液濃度在0.8～1.2OD600時(shí)，幼苗成苗率又極顯著升高（P＜0.01）；此后幼苗成苗率極顯著下降（P＜0.01），除西稷3號(hào)0.8和1.6OD600處理差異不顯著外，其余各處理間差異均達(dá)極顯著水平，說明農(nóng)桿菌菌液濃度過高對(duì)柳枝稷幼苗有毒害作用。

圖1 農(nóng)桿菌不同菌液濃度對(duì)柳枝稷種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Influence of different concentration of A.tumefaciens on seed germination rate of P.virgatum

圖2 農(nóng)桿菌不同菌液濃度對(duì)柳枝稷幼苗成苗率的影響Fig.2 Influence of different concentration of A.tumefaciens on seedlings rate of P.virgatum

2.3 農(nóng)桿菌不同菌液濃度對(duì)柳枝稷幼苗葉綠素含量的影響

農(nóng)桿菌對(duì)柳枝稷幼苗葉綠素含量的影響是隨菌液濃度的升高幼苗葉綠素含量呈極顯著下降趨勢（P＜0.01）（圖3）。經(jīng)方差分析，品系與濃度間互作效應(yīng)不顯著。品系間西稷3號(hào)顯著高于西稷1號(hào)（P＜0.05），極顯著高于西稷2號(hào)（P＜0.01），而西稷1號(hào)與2號(hào)差異不顯著。農(nóng)桿菌對(duì)柳枝稷幼苗葉綠素含量的影響隨濃度的升高明顯增大，不同菌液濃度處理與對(duì)照間差異均達(dá)極顯著水平（P＜0.01），這表明農(nóng)桿菌對(duì)幼苗葉綠素的合成具有不利影響，且影響隨菌液濃度的增大而增大。

2.4 農(nóng)桿菌不同菌液濃度對(duì)柳枝稷幼苗SOD活性的影響

當(dāng)植物處于逆境條件下，一方面使活性氧產(chǎn)生加快，另一方面植物本身會(huì)促使以超氧化物歧化酶（SOD）為主的保護(hù)系統(tǒng)的酶活性升高，以減少細(xì)胞膜系統(tǒng)及生物大分子受到的損傷［22，23］。

農(nóng)桿菌對(duì)柳枝稷幼苗SOD活性的影響是隨菌液濃度的增大表現(xiàn)出先升后降的趨勢，在1.2OD600時(shí)達(dá)到最大值（圖4）。方差分析結(jié)果表明，品系與濃度間的互作效應(yīng)不顯著。品系間西稷3號(hào)極顯著高于西稷1號(hào)、2號(hào)（P＜0.01），而后兩者差異不顯著。在菌液濃度≤1.2OD600時(shí)，不同品系SOD活性極顯著上升（P＜0.01）；而當(dāng)濃度達(dá)到1.6OD600時(shí)，SOD活性則極顯著降低（P＜0.01）。除西稷2號(hào)1.6OD600處理與對(duì)照間差異顯著外（P＜0.05），其余各處理間差異均達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。這表明農(nóng)桿菌對(duì)柳枝稷幼苗的傷害隨菌液濃度的增大而增大。在低濃度（≤1.2OD600）時(shí)，農(nóng)桿菌對(duì)幼苗已經(jīng)造成傷害，但植物本身可能還可以通過自身的保護(hù)作用進(jìn)行修復(fù)，而當(dāng)濃度繼續(xù)增大，其傷害已經(jīng)超過幼苗的自身保護(hù)作用，植物受到嚴(yán)重傷害，最終影響幼苗的正常生長發(fā)育，甚至出現(xiàn)死苗現(xiàn)象。

2.5 農(nóng)桿菌不同菌液濃度對(duì)柳枝稷幼苗CAT活性的影響

過氧化氫酶（CAT）普遍存在于植物組織中，是一種酶類清除劑，又稱為觸酶。它與超氧化物歧化酶（SOD），過氧化物酶（POD）等協(xié)同作用，可促使SOD酶產(chǎn)生的H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一［22，23］。

農(nóng)桿菌對(duì)柳枝稷幼苗CAT活性的影響是隨菌液濃度的升高而呈上升趨勢（圖5），尤其是在濃度超過1.2 OD600時(shí)上升的速率更快。經(jīng)方差分析，品系與濃度間互作效應(yīng)不顯著；農(nóng)桿菌不同菌液濃度對(duì)柳枝稷不同品系幼苗CAT活性的影響存在差異，其中西稷1號(hào)和2號(hào)極顯著的高于西稷3號(hào)（P＜0.01），而前兩者差異不顯著。在菌液濃度≤0.8OD600時(shí)，柳枝稷不同品系幼苗CAT活性均極顯著上升（P＜0.01）；在0.8～1.2OD600間，西稷3號(hào)極顯著升高（P＜0.01），西稷1號(hào)上升趨勢不再顯著，而西稷2號(hào)則極顯著下降（P＜0.01）；此后幼苗CAT活性又均極顯著升高（P＜0.01）。這也證實(shí)農(nóng)桿菌對(duì)柳枝稷幼苗的傷害是隨菌液濃度的升高而增大，尤其是在濃度超過1.2OD600時(shí)傷害更明顯。

2.6 農(nóng)桿菌不同菌液濃度對(duì)柳枝稷幼苗POD活性的影響

過氧化物酶（POD）是植物體內(nèi)普遍存在且活性較高的一種酶，主要存在于植物細(xì)胞的過氧化物酶體中，可催化過氧化氫、氧化酚類和胺類化合物，具有消除氧代謝中產(chǎn)生的過氧化氫和酚類、胺類等毒性物質(zhì)的作用，是植物體內(nèi)的保護(hù)酶之一［22］。

農(nóng)桿菌對(duì)柳枝稷幼苗POD活性的影響與CAT活性的影響相似，隨菌液濃度的升高而升高，尤其是在濃度超過0.8OD600時(shí)上升的更快（圖6）。經(jīng)方差分析，品系與菌液濃度的互作效應(yīng)不顯著。而農(nóng)桿菌對(duì)不同柳枝稷品系POD活性的影響存在差異，其中表現(xiàn)趨勢為西稷2號(hào)＞西稷3號(hào)＞西稷1號(hào)。農(nóng)桿菌不同菌液濃度與對(duì)照間差異均達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。再次說明農(nóng)桿菌對(duì)柳枝稷具有傷害作用，且傷害程度隨菌液濃度的增大而增大。

圖3 農(nóng)桿菌不同菌液濃度對(duì)柳枝稷幼苗葉綠素含量的影響Fig.3 Influence of different concentration of A.tumefaciens on seedlings chlorophyll content of P.virgatum

圖4 農(nóng)桿菌不同菌液濃度對(duì)柳枝稷幼苗SOD活性的影響Fig.4 Influence of different concentration of A.tumefaciens on seedlings SOD activity of P.virgatum

圖5 農(nóng)桿菌不同菌液濃度對(duì)柳枝稷幼苗CAT活性的影響Fig.5 Influence of different concentration of A.tumefaciens on seedlings CAT activity of P.virgatum

圖6 農(nóng)桿菌不同菌液濃度對(duì)柳枝稷幼苗POD活性的影響Fig.6 Influence of different concentration of A.tumefaciens on seedlings POD activity of P.virgatum

2.7 農(nóng)桿菌不同菌液濃度對(duì)柳枝稷幼苗MDA含量的影響

植物在逆境下遭受傷害與活性氧積累誘發(fā)的膜脂過氧化作用密切有關(guān)，丙二醛（MDA）是膜脂過氧化作用最重要的產(chǎn)物之一，通過測定MDA可以間接測定膜系統(tǒng)受損傷的程度［23］。

農(nóng)桿菌對(duì)柳枝稷幼苗MDA含量的影響是隨菌液濃度的升高而呈上升趨勢，尤其是在濃度超過0.8 OD600時(shí)，其上升速率變得更大（圖7）。經(jīng)方差分析，品系與濃度間的互作效應(yīng)不顯著。農(nóng)桿菌對(duì)不同柳枝稷品系MDA含量的影響存在差異，其表現(xiàn)為西稷1、2號(hào)極顯著高于西稷3號(hào)（P＜0.01），而前兩者的差異不顯著。不同菌液濃度處理與對(duì)照間差異均達(dá)極顯著水平（P＜0.01），同一品種不同濃度處理間除西稷2號(hào)中1.2與1.6OD600處理差異不顯著外，其余均達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。同樣反映了農(nóng)桿菌對(duì)柳枝稷具有不利影響，且其影響隨農(nóng)桿菌濃度的增加而增大。

圖7 農(nóng)桿菌不同菌液濃度對(duì)柳枝稷幼苗MDA含量的影響Fig.7 Influence of different concentration of A.tumefaciens on seedlings MDA content of P.virgatum

3 結(jié)論與討論

在逆境條件下，植物通常會(huì)表現(xiàn)出衰老加速的趨勢，即葉綠素含量降低，葉色變黃，蛋白質(zhì)、核酸等大分子水解加速，原生質(zhì)膜以及內(nèi)膜系統(tǒng)發(fā)生過氧化，細(xì)胞膜透性和膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量增加，SOD、CAT和POD酶促防御系統(tǒng)活性下降［23，24］。蔡建一等［25］認(rèn)為SOD、CAT和POD三種酶在活性氧清除過程中具有較強(qiáng)的協(xié)調(diào)能力。在本試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，SOD活性是呈先升后降的趨勢，而CAT和POD則是呈上升趨勢，每種酶在不同程度的脅迫中所起的作用大小有所不同，在低濃度的農(nóng)桿菌侵染脅迫下，SOD的活性較高起主要作用，而當(dāng)濃度超過1.2OD600時(shí)，SOD活性降低，CAT和POD起主要作用。

不同基因型的植物對(duì)農(nóng)桿菌的侵染敏感程度也不同［26］。本試驗(yàn)對(duì)柳枝稷不同品系的種子發(fā)芽率、幼苗成苗率、葉綠素含量、SOD活性、CAT活性、POD活性以及MDA含量等指標(biāo)測定結(jié)果表明，農(nóng)桿菌對(duì)不同基因型柳枝稷的影響存在差異，西稷1號(hào)、西稷2號(hào)和西稷3號(hào)對(duì)農(nóng)桿菌的敏感程度有所不同，西稷3號(hào)種子發(fā)芽率、幼苗成苗率、葉綠素含量和SOD活性都較西稷1號(hào)、西稷2號(hào)明顯偏高，而幼苗MDA含量明顯偏低，這表明西稷1、2號(hào)相比西稷3號(hào)對(duì)農(nóng)桿菌的傷害更敏感，因此在進(jìn)行農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，可適當(dāng)提高對(duì)西稷3號(hào)的侵染濃度。

在植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建過程中，轉(zhuǎn)化效率和獲得轉(zhuǎn)基因植株的規(guī)模是評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化體系成功與否的兩大關(guān)鍵因素。陳明利等［27］認(rèn)為農(nóng)桿菌濃度OD600值小于0.5時(shí)，即使采用長時(shí)間侵染，轉(zhuǎn)化效率也不高。同時(shí)，農(nóng)桿菌濃度也不宜過大，否則會(huì)造成農(nóng)桿菌污染，傷害受體的正常生理活動(dòng)和分化，最終難以提高轉(zhuǎn)化效率。在農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，不同作物對(duì)農(nóng)桿菌菌液濃度的敏感程度也不同。奚亞軍等［20］在轉(zhuǎn)化小麥的試驗(yàn)中農(nóng)桿菌采用的1.5OD600，雷江麗等［28］在做中華結(jié)縷草（Zoysia sinica）轉(zhuǎn)化時(shí)農(nóng)桿菌濃度卻采用0.9OD600，而關(guān)于柳枝稷農(nóng)桿菌浸種濃度的文章還未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過設(shè)置不同濃度的農(nóng)桿菌對(duì)柳枝稷種子萌發(fā)及幼苗生長發(fā)育的影響結(jié)果表明，農(nóng)桿菌浸種對(duì)柳枝稷產(chǎn)生不利影響，且其不利影響隨農(nóng)桿菌濃度的增大而增大，尤其是濃度超過1.2 OD600時(shí)，脅迫作用更為明顯。此時(shí)對(duì)柳枝稷種子及幼苗都產(chǎn)生了較為嚴(yán)重的傷害，柳枝稷種子發(fā)芽率顯著降低，幼苗出現(xiàn)生長緩慢、停止甚至出現(xiàn)死苗的現(xiàn)象。因此在充分考慮轉(zhuǎn)基因效率的同時(shí)，更要注意提高幼苗的成苗率，本試驗(yàn)最終結(jié)果顯示在利用農(nóng)桿菌浸種法進(jìn)行柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化中農(nóng)桿菌菌液濃度不應(yīng)超過1.2OD600。

農(nóng)桿菌侵染濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)條件是影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的最主要因素，本試驗(yàn)主要針對(duì)農(nóng)桿菌濃度進(jìn)行研究，而未涉及侵染時(shí)間和共培養(yǎng)條件等其他的影響因素。因此在后面試驗(yàn)中應(yīng)對(duì)侵染時(shí)間和共培養(yǎng)條件以及它們之間的互作效應(yīng)進(jìn)行深入研究。

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