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        替勃龍對(duì)大鼠神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

        2012-06-07 10:40:14宋月平蘇立凱鐘婭莉田文艷
        河北醫(yī)藥 2012年1期
        關(guān)鍵詞:手術(shù)

        宋月平 蘇立凱 鐘婭莉 田文艷

        研究發(fā)現(xiàn),雌激素替代治療能使絕經(jīng)期女性卒中的相對(duì)危險(xiǎn)度(RR)及與卒中相關(guān)的病死率下降[1]。然而雌激素替代治療對(duì)腦卒中的影響機(jī)制迄今仍不十分清楚。本文觀察了替勃龍?jiān)谌?shì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷中腦缺血神經(jīng)細(xì)胞凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,旨在探討它們對(duì)缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5月齡健康雌性SD大鼠30只,體重250~270 g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物使用許可證號(hào):SCXK2003-1-003)。試驗(yàn)期間所有動(dòng)物置于同一室內(nèi),二級(jí)環(huán)境分籠飼養(yǎng),自由飲水,室溫(21±4)℃,光照12 h,黑暗12 h。

        1.1.2 實(shí)驗(yàn)分組:將上述SD大鼠按體重隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組、對(duì)照組、替勃龍組,每組10只。假手術(shù)組行下腹切開(kāi),見(jiàn)到雙側(cè)卵巢,但不切除任何組織;其余2組于腦缺血術(shù)前14 d切除雙側(cè)卵巢。替勃龍組,替勃龍(荷蘭歐加農(nóng)生產(chǎn),南京歐加農(nóng)制藥分裝)0.25mg·kg-1·d-1,灌胃;對(duì)照組每日同等量蒸餾水灌胃。凡術(shù)中出現(xiàn)大鼠死亡,蛛網(wǎng)膜下腔出血或未存活到規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)者,均為模型制作失敗,不納入本實(shí)驗(yàn),再隨機(jī)從備用組補(bǔ)充相應(yīng)的大鼠,以保證每組實(shí)驗(yàn)大鼠數(shù)量不變。

        1.2 腦缺血再灌注模型制作 用改良Longa法制作大腦中動(dòng)脈阻斷(MCAO)模型[1]。以10%水合氯醛(0.33 g/kg)腹腔注射麻醉后,暴露并鈍性游離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA),結(jié)扎同側(cè)CCA近心端和頸外動(dòng)脈(ECA)分叉部,距CCA末端約5 mm處剪口,用直徑0.24 mm的日本尼龍線沿頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)方向插入,深度由分叉部算約計(jì)(18.5±0.5)mm,于ICA近心端結(jié)扎該動(dòng)脈,全層縫合切口,再灌注時(shí)抽出尼龍線10 mm。以動(dòng)物清醒后爬行時(shí)向右轉(zhuǎn)圈(追尾現(xiàn)象),嚴(yán)重時(shí)向右跌倒,提尾時(shí)右前肢內(nèi)收屈曲,為入選標(biāo)準(zhǔn)。于腦缺血手術(shù)2 h后再灌注,24 h后斷頭取腦。

        1.3 觀察指標(biāo)

        1.3.1 神經(jīng)功能評(píng)分:參考Bederson等[2]的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),于取腦前評(píng)分。0分:無(wú)神經(jīng)損傷癥狀;1分:不能完全伸展右側(cè)前爪;2分:向右側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:向右側(cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走,喪失意識(shí)。包括術(shù)后24 h內(nèi)死亡。

        1.3.2 腦梗死體積測(cè)定:大鼠腦缺血2 h,再灌注24 h后斷頭取腦。取左側(cè)大腦半球,冠狀面均勻切成2 mm厚腦片,染色固定,照相測(cè)量并計(jì)算出總的梗死體積。用計(jì)算機(jī)多媒體彩色圖像分析系統(tǒng)測(cè)量腦梗死體積。

        1.3.3 免疫組化細(xì)胞凋亡的檢測(cè):大鼠腦缺血2 h,再灌注24 h后斷頭取腦,距額極3~5 mm冠狀切取材,放入4%多聚甲醛固定24 h后,制成石蠟切片,用于免疫組織化學(xué)染色。①采用TUNEL法原位標(biāo)記DNA片段檢測(cè)凋亡細(xì)胞。具體步驟參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū),原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為美國(guó)ROCHE公司出品。②采用鏈酶菌抗生物素蛋白過(guò)氧化物酶法(streptavidin peroxidase,SP)檢測(cè)抗凋亡基因Bcl-2、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子Bax的表達(dá)。Bcl-2、bax多克隆抗體購(gòu)于河北博海生物工程有限公司。③采用多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics公司Image-Pro Plus)。在光鏡下分析圖象,每張切片采集缺血周邊區(qū)具有代表性10個(gè)高倍視野,計(jì)算平均數(shù)。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以表示,多組間比較進(jìn)行方差分析,兩兩比較采用q檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 神經(jīng)功能評(píng)分 假手術(shù)組神經(jīng)功能評(píng)分為(1.1±0.4)分,替勃龍組(2.3 ±0.5)分,假手術(shù)組為(1.3 ± 0.5)分,假手術(shù)組和替勃龍組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

        2.2 梗死體積 替勃龍組與對(duì)照組比較梗死體積縮小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。見(jiàn)表1。

        表1 3組腦缺血模型大鼠梗死體積比較 n=10,

        表1 3組腦缺血模型大鼠梗死體積比較 n=10,

        注:與假手術(shù)組比較,*P <0.05;與對(duì)照組比較,#P <0.05

        組別 半球體積(mm3) 梗死體積(mm3) 梗死體積百分比(%)260 ±8 47 ±5 18.2 ±2.2對(duì)照組 260±7 65±4* 25.3±2.4*替勃龍組 260±8 47±4# 18.2±2.2假手術(shù)組#

        2.3 TUNEL標(biāo)記結(jié)果 缺血組對(duì)側(cè)僅見(jiàn)數(shù)個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞散在分布,缺血側(cè)可見(jiàn)大量黃棕色陽(yáng)性細(xì)胞,以圓形為主。假手術(shù)組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%,替勃龍組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)11%,對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)28%,與對(duì)照組比較替勃龍組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.01)。見(jiàn)圖1。

        2.4 Bcl-2、Bax在同側(cè)皮層表達(dá)的百分率 在腦組織切片中,Bcl-2、Bax陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為胞質(zhì)棕黃色深染。替勃龍組較對(duì)照組Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞增多,Bax陽(yáng)性細(xì)胞減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.01)。見(jiàn)表2。

        圖1 3組缺血側(cè)皮層陽(yáng)性細(xì)胞(TUNEL×400)

        表2 3組腦缺血模型大鼠腦皮層Bcl-2、Bax表達(dá)水平比較 n=10,

        表2 3組腦缺血模型大鼠腦皮層Bcl-2、Bax表達(dá)水平比較 n=10,

        注:與假手術(shù)組比較,*P <0.01;與對(duì)照組比較,#P <0.01

        Bcl-2/Bax假手術(shù)組組別 Bcl-2表達(dá)(%) Bax表達(dá)(%)32.0 ±2.1 12 ±1 2.65 ±0.05對(duì)照組 5.2 ±1.0* 60 ±2* 0.09 ±0.01*替勃龍組 33.1 ±2.2# 11 ±1# 3.00 ±0.10#

        3 討論

        有研究證實(shí)外源性雌激素可以明顯降低實(shí)驗(yàn)性MCAO大鼠的病死率,減少腦梗死面積,證明外源性雌激素具有缺血性神經(jīng)保護(hù)作用[3]。據(jù)報(bào)道在大腦中動(dòng)脈栓塞所致的局灶性腦缺血后,增加腦內(nèi)的Bcl-2的表達(dá),可減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,提示Bcl-2在缺血性腦損傷的病理發(fā)生中可能起內(nèi)源性保護(hù)作用。Bcl-2家族是目前研究較為深入的與凋亡密切相關(guān)的基因,它既能阻抑壞死又能阻抑凋亡[4]。研究證明,線粒體外膜通透性的改變可引起細(xì)胞凋亡,而這種通透性的改變直接由Bcl-2家族蛋白控制[5]。Bcl-2家族包含一組相關(guān)蛋白,根據(jù)其成員在細(xì)胞凋亡中的作用分為兩類:一類為抗凋亡蛋白,包括Bcl-2;另一類為促凋亡蛋白,包括Bax[6]。抗凋亡蛋白成員和促凋亡蛋白成員之間的協(xié)同作用共同決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡程序。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最重要的一對(duì)互相拮抗的凋亡相關(guān)因子,Bcl-2/Bax的比值在中樞神經(jīng)細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用,比值高,細(xì)胞存活率高;比值低,細(xì)胞存活率低。測(cè)定Bcl-2/Bax比值有利于判斷是否發(fā)生凋亡。以往研究顯示一過(guò)性局灶性腦缺血后促凋亡蛋白Bax表達(dá)明顯增加,且Bax陽(yáng)性反應(yīng)位于 TUNEL陽(yáng)性的細(xì)胞內(nèi),其時(shí)程與空間的分布與TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元一致[6],提示Bax在介導(dǎo)缺血性神經(jīng)元損傷中起重要作用,這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相符合。本實(shí)驗(yàn)觀察到替勃龍用藥組Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)不同程度增加,而B(niǎo)ax的蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)不同程度下降,Bcl-2/Bax比值增加,說(shuō)明替勃龍可能通過(guò)上調(diào)Bcl-2/Bax比值而對(duì)腦缺血再灌注所造成的損傷起到一定的保護(hù)作用。

        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示替勃龍通過(guò)增強(qiáng)缺血再灌注后腦組織內(nèi)Bcl-2的表達(dá),抑制Bax的表達(dá),上調(diào)Bcl-2/Bax的比值,從而改善模型鼠缺血再灌注24 h后神經(jīng)功能缺損評(píng)分,減輕腦梗死體積和腦水腫,表明替勃龍對(duì)局灶腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

        1 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversile middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rate.Stroke,1989,20:84-91.

        2 Bederson JB,Pitts LH,TsujiM,et al.Rat middle cerebral artery occlusion evaluation of the model and development of a neurologic examination.Stroke,1986,17:472-476.

        3 Zhang YQ,Shi J,Rajakumar G,et al.Effects of gender and estradiol treatment on focal brain ischemia.Brain Res,1998,784:321-324.

        4 Wei MC,Zong WX,Cheng EHY,et al.Proapoptotic BAX and BAK:a reguisite gateway to mitochondrial dysfunction and death.Science,2001,292:727-730.

        5 Orrenius S.Mitochondrial regulation of apooptotic cell death.Toxicol Lett,2004,149:19-23.

        6 Hsu SY,Hsueh AJ.Tissue-specific Bcl-2 protein partners in apoptosis:An ovarian paradigm.Physiol Rev,2000,80:593-614.

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