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        ABO基因定型法解決臨床疑難血型定型1例

        2012-11-11 03:55:18趙志弘石翠英喬芳王振雷田亞娟張虹劉敬閃
        河北醫(yī)藥 2012年1期

        趙志弘 石翠英 喬芳 王振雷 田亞娟 張虹 劉敬閃

        近些年來(lái),隨著城市人口的激增,血站不僅在采供血量上增長(zhǎng)很快,而且在實(shí)際工作當(dāng)中出現(xiàn)了更多的正反定型不符標(biāo)本,這些標(biāo)本有來(lái)自血站內(nèi)部檢驗(yàn)科的,也有來(lái)自醫(yī)院臨床的。傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)方法由于其自身局限性[1],因此面臨很大的挑戰(zhàn)。筆者在實(shí)際工作中運(yùn)用ABO基因定型方法解決了一些疑難血型定型的常見(jiàn)問(wèn)題,本文以1例正反定型不符標(biāo)本的鑒定為例報(bào)告如下。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料 患者,女,漢族,87歲,2011年1月因褥瘡入住市第一醫(yī)院治療,曾有輸血史。因ABO血型正反定型不符送我血液中心配型科鑒定。

        1.2 血型血清學(xué)試驗(yàn) 按照文獻(xiàn)[2]操作???A、抗-A1、抗-B、抗-AB、抗-H、抗-M、抗-N、抗球蛋白試劑、標(biāo)準(zhǔn)試劑ABO紅細(xì)胞、譜細(xì)胞均由上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司制備。

        1.3 血型基因定型 采用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物(PCR-SSP)技術(shù)。DNA提取嚴(yán)格按照TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。引物為采用瑞典隆德Olsson等[3]研究小組與筆者自行設(shè)計(jì),內(nèi)對(duì)照為擴(kuò)增人類(lèi)生長(zhǎng)激素基因(HGH),均由上海生工合成。PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)ABI公司9700。引物混合物檢測(cè)的基因特異性、突變位點(diǎn)和PCR產(chǎn)物片段大小見(jiàn)表1。引物序列見(jiàn)表2。

        表1 基因分型引物檢測(cè)的基因特異性、突變位點(diǎn)和PCR產(chǎn)物片段大小

        表2 引物序列

        1.4 PCR反應(yīng)體系 總反應(yīng)體系10 μl,引物濃度10 pmol/μl,dNTPs濃度 10 pmol/μl,基因組 DNA 濃度 50 ng/μl,15 mmol/L MgCL2(SIGMA 公司),內(nèi)對(duì)照引物濃度 5 pmol/μl,5 U/μl Taq DNA聚合酶(Promega),甘油和甲酚紅終濃度分別為5%和0.01%(SIGMA 公司)。

        1.5 PCR循環(huán)參數(shù) 采用熱啟動(dòng)DNA變性技術(shù)96℃預(yù)置7 min,然后按 94℃ 30 s,66℃ 30 s,72℃ 1 min 進(jìn)行 32 個(gè)循環(huán),再72℃延伸2 min。

        1.6 電泳 PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒別,電壓153 V,時(shí)間15 min,DNA Marker DL2000為T(mén)RAASTM公司產(chǎn)品,凝膠成像儀拍照觀察結(jié)果。

        2 結(jié)果

        血清學(xué)鑒定結(jié)果及基因定型結(jié)果見(jiàn)表1,圖1。

        表1 患者血清學(xué)結(jié)果

        圖1 患者基因定型結(jié)果

        3 討論

        患者血型血清學(xué)結(jié)果正反定型不符,正定型為B型,反定型為O型。因反定型B、O細(xì)胞亦發(fā)生凝集,自身細(xì)胞亦凝集,提示該獻(xiàn)血員血清中存在冷凝集素。37℃水浴后,反定型B、O自身細(xì)胞凝集消失,證明該患者血清中存在冷凝集素。至此,定型不符的原因找到?;蚨ㄐ蛨D譜顯示出了其BO基因型:1、4泳道為O基因,2、3泳道為 A 基因,3、5、6泳道為B基因?;颊邩颖驹?、4、5、6泳道擴(kuò)增出了特異性條帶。

        綜上所述,此類(lèi)標(biāo)本在血站或醫(yī)院血庫(kù)的日常工作中經(jīng)常遇到,具有較典型的代表性,應(yīng)用ABO基因定型方法,在3 h內(nèi)可完成從DNA抽提到基因擴(kuò)增的完成,快速、高效,相對(duì)血型血清學(xué)方法,其能在較短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確解決疑難血型標(biāo)本的定型問(wèn)題。血型基因定型技術(shù)是現(xiàn)代分子生物技術(shù)發(fā)展的產(chǎn)物,具有不受檢材限制、不受疾病影響(白血病患者存在血型抗原表達(dá)減弱現(xiàn)象)、不受血清中不規(guī)則抗體、自身抗體的影響及不受假凝集(冷凝集素、血漿蛋白紊亂等)影響的優(yōu)點(diǎn)。因此,基因定型技術(shù)是血型血清學(xué)方法的極好補(bǔ)充,又是廣大血型工作者手中的新武器。

        1 趙桐茂.后基因組時(shí)代的免疫血液學(xué).中國(guó)輸血雜志,2010,23:848-849.

        2 肖星甫主編.輸血技術(shù)手冊(cè).第1版.四川:科學(xué)技術(shù)出版社,1992.494-514.

        3 Olsson ML,Chester MA.Frequent occurrence of a variant allele at the blood group ABO locus.Vox Sang,1996,70:26-30.

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