趙志弘 石翠英 喬芳 王振雷 田亞娟 張虹 劉敬閃

近些年來(lái)，隨著城市人口的激增，血站不僅在采供血量上增長(zhǎng)很快，而且在實(shí)際工作當(dāng)中出現(xiàn)了更多的正反定型不符標(biāo)本，這些標(biāo)本有來(lái)自血站內(nèi)部檢驗(yàn)科的，也有來(lái)自醫(yī)院臨床的。傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)方法由于其自身局限性［1］，因此面臨很大的挑戰(zhàn)。筆者在實(shí)際工作中運(yùn)用ABO基因定型方法解決了一些疑難血型定型的常見(jiàn)問(wèn)題，本文以1例正反定型不符標(biāo)本的鑒定為例報(bào)告如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 患者，女，漢族，87歲，2011年1月因褥瘡入住市第一醫(yī)院治療，曾有輸血史。因ABO血型正反定型不符送我血液中心配型科鑒定。

1．2 血型血清學(xué)試驗(yàn) 按照文獻(xiàn)［2］操作?？?A、抗-A1、抗-B、抗-AB、抗-H、抗-M、抗-N、抗球蛋白試劑、標(biāo)準(zhǔn)試劑ABO紅細(xì)胞、譜細(xì)胞均由上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司制備。

1．3 血型基因定型 采用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物(PCR-SSP)技術(shù)。DNA提取嚴(yán)格按照TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。引物為采用瑞典隆德Olsson等［3］研究小組與筆者自行設(shè)計(jì)，內(nèi)對(duì)照為擴(kuò)增人類(lèi)生長(zhǎng)激素基因(HGH)，均由上海生工合成。PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)ABI公司9700。引物混合物檢測(cè)的基因特異性、突變位點(diǎn)和PCR產(chǎn)物片段大小見(jiàn)表1。引物序列見(jiàn)表2。

表1 基因分型引物檢測(cè)的基因特異性、突變位點(diǎn)和PCR產(chǎn)物片段大小

表2 引物序列

1．4 PCR反應(yīng)體系 總反應(yīng)體系10 μl，引物濃度10 pmol/μl，dNTPs濃度 10 pmol/μl，基因組 DNA 濃度 50 ng/μl，15 mmol/L MgCL2(SIGMA 公司)，內(nèi)對(duì)照引物濃度 5 pmol/μl，5 U/μl Taq DNA聚合酶(Promega)，甘油和甲酚紅終濃度分別為5%和0．01%(SIGMA 公司)。

1．5 PCR循環(huán)參數(shù) 采用熱啟動(dòng)DNA變性技術(shù)96℃預(yù)置7 min，然后按 94℃ 30 s，66℃ 30 s，72℃ 1 min 進(jìn)行 32 個(gè)循環(huán)，再72℃延伸2 min。

1．6 電泳 PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒別，電壓153 V，時(shí)間15 min，DNA Marker DL2000為T(mén)RAASTM公司產(chǎn)品，凝膠成像儀拍照觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

血清學(xué)鑒定結(jié)果及基因定型結(jié)果見(jiàn)表1，圖1。

表1 患者血清學(xué)結(jié)果

圖1 患者基因定型結(jié)果

3 討論

患者血型血清學(xué)結(jié)果正反定型不符，正定型為B型，反定型為O型。因反定型B、O細(xì)胞亦發(fā)生凝集，自身細(xì)胞亦凝集，提示該獻(xiàn)血員血清中存在冷凝集素。37℃水浴后，反定型B、O自身細(xì)胞凝集消失，證明該患者血清中存在冷凝集素。至此，定型不符的原因找到?；蚨ㄐ蛨D譜顯示出了其BO基因型:1、4泳道為O基因，2、3泳道為 A 基因，3、5、6泳道為B基因?；颊邩颖驹?、4、5、6泳道擴(kuò)增出了特異性條帶。

綜上所述，此類(lèi)標(biāo)本在血站或醫(yī)院血庫(kù)的日常工作中經(jīng)常遇到，具有較典型的代表性，應(yīng)用ABO基因定型方法，在3 h內(nèi)可完成從DNA抽提到基因擴(kuò)增的完成，快速、高效，相對(duì)血型血清學(xué)方法，其能在較短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確解決疑難血型標(biāo)本的定型問(wèn)題。血型基因定型技術(shù)是現(xiàn)代分子生物技術(shù)發(fā)展的產(chǎn)物，具有不受檢材限制、不受疾病影響(白血病患者存在血型抗原表達(dá)減弱現(xiàn)象)、不受血清中不規(guī)則抗體、自身抗體的影響及不受假凝集(冷凝集素、血漿蛋白紊亂等)影響的優(yōu)點(diǎn)。因此，基因定型技術(shù)是血型血清學(xué)方法的極好補(bǔ)充，又是廣大血型工作者手中的新武器。

1 趙桐茂．后基因組時(shí)代的免疫血液學(xué)．中國(guó)輸血雜志，2010，23:848-849．

2 肖星甫主編．輸血技術(shù)手冊(cè)．第1版．四川:科學(xué)技術(shù)出版社，1992．494-514．

3 Olsson ML，Chester MA．Frequent occurrence of a variant allele at the blood group ABO locus．Vox Sang，1996，70:26-30．