李紅艷 農(nóng)林玲 李麗婭 胡春萍 龐勇軍

類胡蘿卜素是一類天然的脂溶性色素，廣泛存在于自然界之中。其屬于萜烯類，所有類胡蘿卜素都是由一條共軛雙鍵的核心碳鏈，加上各自不同的末梢基團(tuán)構(gòu)成［1，2］。目前為止，自然界中已經(jīng)確認(rèn)的類胡蘿卜素至少有750多種［3］，其中常見于食物中的有50～60種，如β-胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素、玉米黃質(zhì)、隱黃質(zhì)等。流行病學(xué)調(diào)查顯示，蔬菜水果的攝入量與心血管疾病、眼科疾病、胃腸道疾病、神經(jīng)退行性變以及部分癌癥的發(fā)生，呈負(fù)相關(guān)［4］。這一作用可能和蔬菜水果中富含的類胡蘿卜素和其他植物營養(yǎng)素有關(guān)。蝦青素為一種非維生素A原、廣泛存在于海產(chǎn)甲殼類動物和魚類中的天然類胡蘿卜素。動物實(shí)驗(yàn)表明它有抑制腫瘤發(fā)生、增強(qiáng)免疫功能等多方面的生理作用［2，5，6］。本研究通過天然蝦青素對高脂鵪鶉模型體內(nèi)脂代謝的調(diào)節(jié)及對由高脂誘發(fā)的血管和肝臟脂質(zhì)過氧化損傷的影響及其相關(guān)機(jī)制，探討其最佳作用劑量標(biāo)準(zhǔn)，為其用于臨床相關(guān)疾病的防治提供理論依據(jù)和參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 5%天然蝦青素粉劑(來源于雨生紅球藻)，購于陜西森弗生物技術(shù)有限公司。膽固醇(食品級)，購于安徽科寶生物工程有限公司。高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)測定試劑盒，由上海榮盛生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。凱西萊(tioproin)，河南新誼藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。辛伐他汀片(simvastatin)，杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，上海三浦化工有限公司產(chǎn)品。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 動物分組及處理 雄性鵪鶉50只，5～6周齡，體重100～120 g，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心［動物許可證號:scxk(桂)2007-0001］提供。每籠5只，動物房通風(fēng)良好，光照12 h，濕度50%～60%，每天上、下午自動排風(fēng)，自由飲食、飲水。鵪鶉隨機(jī)分為5組，對照組、高脂模型組、凱西萊與辛伐他汀聯(lián)用組(凱-辛聯(lián)用組)、蝦青素低劑量組、蝦青素高劑量組，每組10只。對照組喂飼基礎(chǔ)飼料;高脂模型組、凱-辛聯(lián)用組、蝦青素低、高2劑量組給予高脂飼料(1%膽固醇+14%豬油+6%花生油+79%基礎(chǔ)飼料)喂飼;高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)每天上午分別灌胃給予相應(yīng)的藥物，蝦青素試驗(yàn)前，先用蔗糖脂肪酸酯乳化，再溶于水配制成蝦青素乳化液;凱西萊及辛伐他汀用0.5%CMC-Na配置成混懸液;蝦青素低、高2劑量組分別按5、10mg/kg標(biāo)準(zhǔn)灌胃;凱-辛聯(lián)用組按10mg/kg凱西萊、1mg/kg辛伐他汀劑量標(biāo)準(zhǔn)灌胃;高脂模型組及對照組灌等體積蔗糖脂肪酸酯溶液。鵪鶉分籠飼養(yǎng)，自由飲水，實(shí)驗(yàn)共7周。

1.3 血液及組織相關(guān)指標(biāo)生物化學(xué)分析 5組鵪鶉均于實(shí)驗(yàn)開始前及結(jié)束時(shí)獲取血液標(biāo)本。禁食12 h頸靜脈取血4℃下放置1 h，3500 r/min離心15min，取血清按試劑盒方法測定總TC、TG、HDL-C、LDL-C、GSH-Px、SOD、iNOS 活性和 MDA 含量 。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動物，留取肝臟作組織勻漿，測定各組動物肝組織勻漿中SOD、GSH-Px、iNOS活性、MDA及GSH的含量;同時(shí)取肝臟左葉部分(100mg)加抽提液(氯仿∶甲醇=1∶1)2ml勻漿，4℃下放置 12 h，3500 r/min，15min，取上清液，按上法測定肝中 TC、TG。

1.4 病理形態(tài)學(xué)觀察 將主動脈用10%甲醛固定，脫水石蠟包埋切片，HE染色，做病理切片檢查。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蝦青素對血脂及肝脂含量的影響 建模前5組血脂含量均無明顯差異(P ＞0.05);建模后鵪鶉血清中TG、TC、LDL-C和HDL-C含量較對照組顯著升高(P ＜0.05或 ＜0.01)，肝臟中TG和TC含量也較對照組顯著升高(P＜0.01)。蝦青素或凱西萊與辛伐他汀聯(lián)用干預(yù)后，鵪鶉血清中TG、TC、LDL-C及肝臟中TG和TC含量均較高脂模型組下降(P＜0.05或＜0.01)，而血清中 HDL-C含量均較高脂模型組升高(P＜0.01);低、高兩劑量蝦青素分別與凱-辛聯(lián)用組干預(yù)效果比較，低濃度的蝦青素干預(yù)效果弱于凱-辛聯(lián)用組(P＜0.05或＜0.01)，高劑量作用效果更為明顯。見表1。

表1 5組血脂和肝脂含量比較 n=10，mmol/L，

表1 5組血脂和肝脂含量比較 n=10，mmol/L，

注:與對照組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與高脂模型組比較，△P ＜0.05，☆P ＜0.01;與凱-辛聯(lián)用組比較，▲P ＜0.05，★P ＜0.01

血脂肝脂組別TG TC對照組 1.08 ±0.46 4.71 ±0.96 1.82 ±0.26 4.23 ±1.08 0.8 TG TC LDL-C HDL-C 2 ±0.38 0.25 ±0.14高脂模型組 6.76 ±0.66# 98.61 ±1.13# 7.34 ±1.32# 5.31 ±0.41* 2.20 ±0.99# 2.69 ±0.32#凱-辛聯(lián)用組 2.83 ±0.12＊☆ 52.94 ±2.79#☆ 4.66 ±1.98#☆ 9.78 ±1.75＊☆ 1.01 ±0.33#☆ 0.62 ±0.51#☆蝦青素低劑量組 3.31±0.39＊☆★ 75.62±4.88#☆★ 6.17±0.59#△▲ 8.69±1.42＊☆ 1.46±0.21#△★ 2.35±0.13#△★蝦青素高劑量組 3.03±0.55＊☆ 54.79±3.36#☆ 5.58±1.40#△ 10.14±0.13＊☆ 1.13±0.58#△ 0.80±0.43#☆

2.2 蝦青素對血清SOD、GSH-Px、iNOS活性及MDA含量的影響 高脂喂食后，鵪鶉血清 SOD、GSH-Px活性下降(P＜0.01)，而iNOS活性與 MDA 含量上升(P ＜0.01);蝦青素或凱西萊與辛伐他汀聯(lián)用干預(yù)后，血清SOD，GSH-Px活性有所上升(P ＜0.05或 ＜0.01)，iNOS活性與 MDA含量下降(P ＜0.01);低、高2劑量蝦青素分別與凱-辛聯(lián)用組干預(yù)效果比較，低濃度的蝦青素干預(yù)效果弱于凱-辛聯(lián)用組(P＜0.05或＜0.01)，高劑量作用效果更為理想。見表2。

表2 5組血清SOD、GSH-Px、iNOS活性及MDA含量比較 n=10，

表2 5組血清SOD、GSH-Px、iNOS活性及MDA含量比較 n=10，

注:與對照組比較，*P ＜0.01;與高脂模型組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01;與凱-辛聯(lián)用組比較，☆P ＜0.05，▲P ＜0.01

組別 SOD(U/ml) GSH-Px(U/ml) iNOS(U/ml) MDA(nmol/ml)93 ±16 756 ±13 15.2 ±2.7 12.4 ±1.8高脂模型組 22±7* 285±10* 237.0±1.6* 163.0±1.0*凱-辛聯(lián)用組 45±12△ 527±12△ 93.3±5.6△ 53.4±2.2△蝦青素低劑量組 32±9#☆ 449±9△▲ 126.5±3.9△▲ 83.3±3.6△▲蝦青素高劑量組 43±16△ 530±10△ 91.7±2.8△ 52.3±3.1對照組△

2.3 蝦青素對肝組織中SOD、GSH-Px、iNOS活性及MDA、GSH含量的影響 高脂喂食后，鵪鶉肝組織中SOD、GSH-Px活性及GSH含量顯著降低(P＜0.01)，而iNOS活性與MDA含量明顯上升(P＜0.01);蝦青素或凱西萊與辛伐他汀聯(lián)用干預(yù)后，肝組織中SOD，GSH-Px活性及 GSH含量上升(P ＜0.05或 ＜0.01)，iNOS活性與 MDA 含量下降(P ＜0.05 或 ＜0.01);低、高2劑量蝦青素分別與凱-辛聯(lián)用組干預(yù)效果比較顯示，低濃度的蝦青素干預(yù)效果弱于凱-辛聯(lián)用組(P ＜0.05或 ＜0.01)，高劑量作用效果更為理想。見表3。

表3 5組肝組織SOD、GSH-Px、iNOS活性及MDA、GSH含量比較 n=10，

表3 5組肝組織SOD、GSH-Px、iNOS活性及MDA、GSH含量比較 n=10，

注:與對照組比較，*P ＜0.01;與高脂模型組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01;與凱-辛聯(lián)用組比較，☆P ＜0.05，▲P ＜0.01

組別 SOD(U/mgpro) GSH-Px(U/mgpro) iNOS(U/mgpro) GSH(mg/gpro) MDA(nmol/mgpro)17.2 ±6.8 64 ±18 0.38 ±0.11 35 ±8 0.64 ±0.15高脂模型組 4.3±2.5* 16±6* 1.20±0.42* 19±5* 1.51±0.38*凱-辛聯(lián)用組 12.5±3.2△ 45±10△ 0.62±0.23△ 28±5△ 0.87±0.22△蝦青素低劑量組 7.3±2.8#▲ 25±10#▲ 0.88±0.14#☆ 22±6☆ 1.17±0.18#▲蝦青素高劑量組 13.6±5.6△ 43±14△ 0.56±0.39△ 27±8# 0.81±0.27對照組△

2.4 主動脈切片HE染色結(jié)果 對照組主動脈弓內(nèi)膜完整無明顯變化。高脂模型組主動脈弓內(nèi)膜見不同程度的斑塊隆起，斑塊中見大量的泡沫細(xì)胞。蝦青素低、高2劑量及凱-辛聯(lián)用組主動脈弓內(nèi)膜斑塊形成均較高脂模型組有明顯的改善，且高劑量蝦青素改善效果更理想。見圖1。

圖1 鵪鶉主動脈內(nèi)膜顯微鏡照片(HE×100)

3 討論

心腦血管疾病是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，有關(guān)病因及其防治措施一直受到人們的關(guān)注。動脈粥樣硬化(AS)的主要病變特征為動脈某些部位的內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積，并伴有平滑肌細(xì)胞和纖維基質(zhì)成分的增殖，逐步發(fā)展形成AS性斑塊。LDL-C在AS的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用，LDL促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展主要通過氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的作用得以實(shí)現(xiàn)。研究表明，ox-LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的增生和凋亡［7］，VSMC位于血管中膜層，ox-LDL引起平滑肌細(xì)胞從血管中膜移行入內(nèi)膜，并通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及血小板細(xì)胞產(chǎn)生血小板源性生長因子(PDGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，促進(jìn)平滑肌增生，并分泌基質(zhì)使血管內(nèi)膜增厚［8－10］。內(nèi)皮細(xì)胞對自由基和脂質(zhì)過氧化作用非常敏感。LDL氧化過程中產(chǎn)生的過氧化脂質(zhì)可以直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞。Ox-LDL可使內(nèi)皮細(xì)胞對LDL的通透性增高，胞漿發(fā)生空泡變性，漿膜皺縮，甚至可使細(xì)胞最終壞死［11，12］。Ox-LDL 能促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中，損壞了線粒體膜，進(jìn)而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡［13］。而高脂血癥可導(dǎo)致氧自由基及其他活性氧成分釋放增多，從而造成大量LDL被氧化，促進(jìn)血管脂質(zhì)過氧化損傷的進(jìn)一步發(fā)展。血清中高密度脂蛋白(HDL)與心血管事件危險(xiǎn)性呈負(fù)相關(guān)，被認(rèn)為是一種保護(hù)性脂蛋白。HDL通過參與膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)、拮抗LDL氧化、保護(hù)內(nèi)皮功能等機(jī)制發(fā)揮其抗AS作用。在脂質(zhì)代謝過程中，肝臟是重要的臟器，維持肝臟功能的正常，對脂質(zhì)代謝，抑制過氧化損傷都有很重要的意義。本實(shí)驗(yàn)用高脂飼料飼喂鵪鶉建立鵪鶉高脂血癥模型，與人類因膳食結(jié)構(gòu)改變而形成的高脂血癥相似，對人類高脂血癥的研究具有指導(dǎo)意義。本研究結(jié)果顯示，蝦青素能有效降低血漿中TG、TC、LDL含量，顯著增加血漿中HDL含量;同時(shí)均能顯著降低肝中內(nèi)源性TG、TC的合成量。以上結(jié)果表明，蝦青素具有較強(qiáng)的降脂功效，其對血脂和肝脂含量均有很好的調(diào)節(jié)作用。

機(jī)體內(nèi)促氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡的破壞，是導(dǎo)致各種自由基氧化損傷疾病產(chǎn)生的最重要的原因。動物體內(nèi)自由基是機(jī)體氧化過程中釋放的一種活潑的有害物質(zhì)，它在機(jī)體內(nèi)肆意掠奪其他分子的電子，破壞重要生物大分子(如細(xì)胞酶、DNA、RNA、蛋白質(zhì)等)的結(jié)構(gòu)，使其喪失生理功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞、酶失去活性、基因受損、細(xì)胞變異，使體內(nèi)重要組織臟器功能低下，導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的超氧陰離子(O－2)、羥自由基(OH－)、過氧化氫(H2O2)直接充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)信號分子或通過充當(dāng)細(xì)胞膜或胞核受體的配體而調(diào)節(jié)多個(gè)類別的基因表達(dá)，包括黏附分子及化學(xué)趨化因子的表達(dá)增加，在As病變早期起著關(guān)鍵作用［14］。氧應(yīng)激被認(rèn)為是肝臟脂肪變發(fā)展為脂肪性肝炎的催化劑，氧應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化損傷在脂肪肝的形成和發(fā)展過程中起重要作用，是脂肪肝受到第二次打擊進(jìn)一步發(fā)展的重要因素。此外，高血脂時(shí)體內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除平衡被破壞，許多自由基清除劑(如SOD、CAT)活性降低，產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物(LPO)。因此，維持機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的正常工作是防治自由基氧化損傷所致疾病的重要措施。SOD是一種廣泛存在于生物體內(nèi)與細(xì)胞氧化代謝密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，是活性氧自由基的天然消除劑，是抗氧化酶系中最先與活性氧自由基結(jié)合的酶類。SOD能特異性結(jié)合體內(nèi)超氧陰離子，且可與GSH-Px協(xié)同作用防止脂質(zhì)過氧化及其代謝產(chǎn)物對機(jī)體的損害［15］，還可直接捕捉和清除超氧陰離子等自由基［16］，通過氫原子供體的作用阻斷或終止自由基連鎖反應(yīng)鏈，從而阻止和抑制氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的病理性加劇，起到抗氧化作用。GSH-Px能催化過氧化氫的還原反應(yīng)，對由活性氧和羥自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物及過氧化氫有極強(qiáng)的清除能力，從而保護(hù)生物大分子和生物膜結(jié)構(gòu)免受過氧化物損傷［17］。GSH是機(jī)體內(nèi)一種重要的抗氧化小分子，其為一種三肽化合物;在GSH-Px的催化下，GSH可還原細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過氧化物，與此同時(shí)，GSH被氧化成氧化型谷胱甘肽(GSSG);后者在谷胱甘肽還原酶(GR)催化下，再生成GSH。檢測體內(nèi)GSH的含量可間接反映出GR活性的高低。一氧化氮(NO)是近年來逐漸明確的細(xì)胞信息分子，具有維持血管張力、調(diào)節(jié)血壓，抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移、增生，抑制血小板聚集與白細(xì)胞對血管壁的黏附、調(diào)節(jié)影響心肌收縮與舒張功能的作用［18］。作為決定NO生成的酶，一氧化氮合酶(NOS)在體內(nèi)廣泛分布，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞是最集中部位［19］。體內(nèi)NOS存在3種異構(gòu)體，根據(jù)其首次克隆時(shí)所在組織不同，分別命名為:內(nèi)皮型NOS(eNOS)、神經(jīng)型NOS(nNOS)、巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)型NOS(iNOS)，其中eNOS和nNOS合稱為結(jié)構(gòu)型NOS(cNOS)。研究認(rèn)為，由cNOS催化產(chǎn)生的NO主要起生理信使作用，而由iNOS產(chǎn)生的NO主要參與免疫炎性反應(yīng)和細(xì)胞毒作用。心血管疾病包括動脈粥樣硬化、心肌缺血、缺血再灌注損傷、充血性心衰等都與iNOS表達(dá)過量NO緊密相關(guān)［20］。在人動脈粥樣硬化主動脈的脂質(zhì)條紋病變和粥樣硬化病變部位，iNOS在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中廣泛表達(dá)，蛋白修飾明顯增多并多存在于iNOS陽性部位。在動脈粥樣硬化的早期，斑點(diǎn)中就發(fā)現(xiàn)iNOS活化，由iNOS衍生的過量NO誘導(dǎo)的硝化應(yīng)激又加重了動脈粥樣硬化［21］。有研究顯示由iNOS活性增加而致高濃度的NO產(chǎn)生，可抑制肝細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成、損傷DNA結(jié)構(gòu)，直接抑制線粒體呼吸，使肝細(xì)胞內(nèi)能量代謝障礙而引起肝細(xì)胞凋亡和壞死［21］;同時(shí)，高濃度NO與氧自由基反應(yīng)生成超氧化亞硝基陰離子(ONOO－)，后者是蛋白和非蛋白巰基的強(qiáng)氧化劑，攻擊肝星狀細(xì)胞引發(fā)脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)研究的天然蝦青素具有特殊的分子結(jié)構(gòu)，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它是單線態(tài)氧的強(qiáng)淬滅劑;在雨生紅球藻活細(xì)胞內(nèi)，它作為光保護(hù)劑和強(qiáng)抗氧化劑，能夠淬滅由強(qiáng)光和過度氧化產(chǎn)生的多種活性氧，防止活性氧對細(xì)胞的傷害。

本研究結(jié)果顯示，鵪鶉高脂狀態(tài)下血清和肝組織中SOD、GSH-Px活性均較對照組有明顯的下降，iNOS活性均顯著高于對照組;而蝦青素能顯著增強(qiáng)此兩種抗氧化酶的活性，并且強(qiáng)烈抑制iNOS活性，從而有效緩解由高脂誘發(fā)的機(jī)體脂質(zhì)過氧化損傷的程度。本研究通過鵪鶉高脂動物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察顯示，蝦青素具有很好的降脂功效;并對高脂誘發(fā)的血管及肝臟脂質(zhì)過氧化損傷有明顯的抑制作用;高劑量蝦青素(10mg/kg)作用效果更為理想。

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