宋 超，靳曉麗，田新會(huì)，杜文華

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070）

紅三葉（Trifolium pratense）又名紅車軸草、紅花苜蓿、金菜花、紅荷蘭翹搖等，為豆科三葉草屬牧草，是世界上栽培最早和最重要的牧草之一。在英國(guó)和新西蘭，它是繼白三葉（Trifolium repens）之后的第2大豆科牧草，在美國(guó)，種植面積僅次于紫花苜蓿（Medicago sativa）［1－3］。目前，已成為歐洲，加拿大及澳大利亞等地區(qū)重要栽培豆科牧草之一。我國(guó)江淮流域、華南、西南等地均有栽培，是我國(guó)長(zhǎng)江流域以南及甘肅省高寒陰濕區(qū)優(yōu)良的豆科牧草［4－9］。紅三葉異黃酮具有抗癌，調(diào)節(jié)激素平衡，改善骨質(zhì)疏松，婦女更年期綜合癥等作用［10－12］，是一種極具開(kāi)發(fā)前景的藥用植物。杜文華等［13，14］研究表明，目前國(guó)內(nèi)審定登記的5個(gè)紅三葉品種均屬中低異黃酮品種，且重度感染白粉病。因此，如何提高甘肅省主栽紅三葉品種岷山紅三葉的異黃酮含量以及抗性成為當(dāng)前紅三葉生產(chǎn)亟待解決的問(wèn)題。國(guó)外種質(zhì)資源由于地域差異，有時(shí)會(huì)表現(xiàn)出優(yōu)異的特性［15］。筆者將收集到的5份澳大利亞紅三葉品種，在蘭州地區(qū)試種，以期從中選擇高產(chǎn)抗病品種，為紅三葉育種提供優(yōu)異種質(zhì)資源。

1 材料和方法

1.1 供試材料及引種地氣候概況

供試5個(gè)品種系澳大利亞?wèn)|南沿海引進(jìn)（表1），海拔50～200m，屬亞熱帶濕潤(rùn)氣候，年降水量2000 mm，主要集中在春秋兩季。全年普遍偏暖，年溫度變化12～38℃，少見(jiàn)霜期。岷山紅三葉為對(duì)照。

表1 供試材料及來(lái)源Table 1 Varieties and resources for test

1.2 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)校園試驗(yàn)地進(jìn)行。地理位置N 36°03′，E 103°52′，海拔1 560m ，年均氣溫8.5℃，降水量380mm，蒸發(fā)量1 486.5mm，無(wú)霜期171d。土壤栗鈣土，有機(jī)質(zhì)含量0.84%，pH 7.28，含鹽量為0.25%，有效氮95.05mg/kg，有效磷7.32mg/kg，有效鉀182.80mg/kg。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及管理

2011年3月29日進(jìn)行播種，播量15kg/hm2，東西向條播，行距30cm，播深1～2cm，出苗后淺水漫灌保苗，之后視土壤水分狀況適量灌水。播種前精細(xì)整地，施尿素（60kg/hm2）、鉀肥（45kg/hm2）各1次。苗期、現(xiàn)蕾期、開(kāi)花期和結(jié)莢期分別灌水，防除雜草，其他同大田管理。

1.4 觀測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 物候期觀察 觀測(cè)出苗期、分枝期、現(xiàn)蕾期、開(kāi)花期、結(jié)莢期、成熟期，二年生牧草返青期。目測(cè)50%植株達(dá)到該物候期為準(zhǔn)。具體物候期的劃分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［8］。

1.4.2 分枝數(shù)、葉面積和株高 第1次刈割時(shí)（初花期，小區(qū)內(nèi)有20%植株開(kāi)花）測(cè)定分枝數(shù)，按株行取樣（1m樣段），重復(fù)3次，計(jì)算平均值；葉面積選取主莖第1枚花序處三出復(fù)葉的中部葉片，測(cè)定葉長(zhǎng)和葉寬，采用A＝KLW（A葉面積；K校正系數(shù)；L葉長(zhǎng)；W 葉寬）計(jì)算葉面積［16］；株高 在各小區(qū)內(nèi)分別選取有代表性株行，測(cè)定自然高度，重復(fù)5次，計(jì)算平均值。

1.4.3 草產(chǎn)量、莖葉比和鮮干比 初花期進(jìn)行。每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取有代表性株行取1m樣段，齊地面刈割，稱取鮮草重。刈割后，在紅三葉到達(dá)同一生育期時(shí)，再次刈割，計(jì)算年產(chǎn)草量。初花期隨機(jī)抽取10個(gè)枝條，分別測(cè)定葉片重（剛開(kāi)放的花序作為葉片）和莖稈重，計(jì)算莖葉比。將收獲的鮮草分別置于65～70℃干燥箱內(nèi)烘7～8h，稱取干草重。根據(jù)鮮草和干草重，計(jì)算鮮干比，結(jié)果以2次測(cè)定的平均值表示。

1.4.4 花序長(zhǎng)度、小花數(shù)和千粒質(zhì)量 花序長(zhǎng)度和小花數(shù)在各品種盛花期隨機(jī)挑選花序10個(gè)，分別測(cè)定花序長(zhǎng)度和每個(gè)花序的小花數(shù)；千粒質(zhì)量 從各品種中隨機(jī)數(shù)取1000粒種子，稱重，設(shè)3次重復(fù)，求其平均值。

1.4.5 營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定 室內(nèi)分別測(cè)定2次刈割后各品種的水分、粗蛋白、粗纖維、粗灰分和粗脂肪含量。粗蛋白含量采用半微量凱氏定氮法；粗纖維含量采用酸堿法；粗灰分含量采用灰化法；粗脂肪含量采用索氏抽提法。結(jié)果以兩次測(cè)定的平均值表示［17］。

1.4.6 異黃酮含量分析 精確稱取紅三葉樣品2g，用脫脂濾紙包好，置于全自動(dòng)索氏抽提儀中，加入50 mL 70%乙醇浸泡10h后在90～95℃恒溫水浴條件下抽提10h，提取液用75%乙醇定容至50mL。取紅三葉異黃酮提取液5mL，置于10mL水解管中，加入37%HCl 2mL，在83～85℃恒溫水浴鍋中水解2.5 h，取出后冷卻至室溫，用70%乙醇定容至10mL。取2mL水解液經(jīng)0.45μL微孔膜至2mL離心管中，進(jìn)行液相色譜分析。

異黃酮高效液相色譜分析 檢測(cè)器為Agilent1100VWD可變波長(zhǎng)檢測(cè)器；分析柱Eclipse XDB－C8（4.6×150mm）；檢測(cè)波長(zhǎng)260nm（檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定參照文獻(xiàn)［18］），流動(dòng)相為乙腈水梯度洗脫，25min內(nèi)乙腈由20%增加到70%；1mL/min流速；進(jìn)樣量20μL，首先進(jìn)混標(biāo)樣1針，之后每4個(gè)樣品后進(jìn)一針混標(biāo)樣。

1.4.7 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2003，SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同紅三葉品種物候期

6個(gè)紅三葉品種播種當(dāng)年，岷山紅三葉從出苗到成熟期時(shí)間最短，與3、4、5號(hào)紅三葉相比較提前5～10d，1、2號(hào)紅三葉的物候期與岷山紅三葉相比較長(zhǎng)，約20d（表2）。出苗期到開(kāi)花期最短的是岷山紅三葉，為86d，最長(zhǎng)的1、2號(hào)為97d，可能是由于1～5號(hào)品種由熱帶亞熱帶引進(jìn)，蘭州地區(qū)年均溫較低，其生長(zhǎng)發(fā)育減緩所致。

表2 不同紅三葉品種播種當(dāng)年的物候期Table 2 Phenological phases of red clover varieties in the first year月－日

2.2 不同紅三葉品種分枝數(shù)，葉面積及株高

不同紅三葉品種的分枝數(shù)，葉面積和株高均存在差異（圖1）。4號(hào)的分枝數(shù)最多，為42個(gè)/m，除與2號(hào)和ck無(wú)顯著差異外，與其他品種間均差異顯著（P＜0.05）；4號(hào)葉面積最大，為7.15cm2，與除ck外的其他品種均有顯著差異；3號(hào)株高為65.4cm，顯著高于其他品種。

圖1 紅三葉品種當(dāng)年分枝數(shù)、株高及葉面積Fig.1 The number of shoot，leaf area and plant height of the different red clover varieties in the first year

2.3 不同紅三葉品種小花數(shù)、花序長(zhǎng)和千粒質(zhì)量比較

6個(gè)紅三葉品種的花序長(zhǎng)度無(wú)顯著差異，變幅為3.43～3.76cm（圖2）。其中，5號(hào)小花數(shù)最多，為130個(gè)/花序，其次為岷山紅三葉（120個(gè)/花序），1號(hào)最少，為103個(gè)/花序；4號(hào)千粒質(zhì)量最高，為1.58g，與其他品種間均存在顯著差異（P＜0.05），2號(hào)最低，為1.47 g。

圖2 不同紅三葉品種生長(zhǎng)當(dāng)年小花數(shù)，花序長(zhǎng)及千粒質(zhì)量Fig.2 The number of floret per inflorescence，and TSW of red clover varieties inthe first year

2.4 不同紅三葉品種產(chǎn)草量、鮮干比和莖葉比

第1茬、第2茬產(chǎn)草量最高的均為4號(hào)紅三葉，其年產(chǎn)草量與其他品種間均存在顯著差異（5號(hào)除外）；1號(hào)第2茬產(chǎn)量占第1茬的85%，說(shuō)明其再生性能良好，ck次之，2號(hào)再生性能較差；4號(hào)紅三葉鮮干比最小，顯著低于其他品種，鮮干比最高的為3號(hào)，與其他品種均存在顯著差異（P＜0.05），說(shuō)明4號(hào)紅三葉積累干物質(zhì)的能力較強(qiáng)（表3）。莖葉比最高的為2號(hào)紅三葉，顯著高于其余品種，說(shuō)明其葉量較大，具有較好的適口性。

表3 不同紅三葉品種的產(chǎn)草量、鮮干比和莖葉比Table 3 Hay yield，leaf stem ratio and fresh dry ratio of 6 red clover varieties in the first year

2.5 不同紅三葉品種營(yíng)養(yǎng)成分比較

在6個(gè)紅三葉品種中，1號(hào)粗蛋白含量最高，4號(hào)次之，5號(hào)最低；2號(hào)粗纖維含量最低（21.07%），5號(hào)粗纖維含量最高（26.86%），其他品種粗纖維含量均在21%～23%。粗脂肪含量最高的為4號(hào)（2.51%），5號(hào)最低（2.11%）；5號(hào)粗纖維含量顯著高于其他品種。6個(gè)紅三葉品種中鈣、磷含量變動(dòng)不大，分別在1.12%～1.35%和0.28%～0.32%（表4）。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)粗蛋白含量較高的紅三葉品種，其粗纖維含量一般較低，且鮮干比和莖葉比較高，這可能是由于葉片中纖維素含量低，而葉量較多，積累糖類的能力較強(qiáng)，可轉(zhuǎn)化為較多的蛋白類物質(zhì)所致。

表4 不同紅三葉品種營(yíng)養(yǎng)成分Table 4 Comparison on the nutrition value among red clover varieties in the first year%

2.6 不同紅三葉品種異黃酮含量比較

根據(jù)混標(biāo)溶液與樣品水解液的HPLC圖譜做出擬合度曲線（圖3），樣品與混標(biāo)液的擬合度較準(zhǔn)確。圖3中各異黃酮單體的出峰位置按時(shí)間先后順序分別為大豆黃素、染料木素、刺芒柄花素、鷹嘴豆芽素A，參照此出峰順序以及出峰時(shí)間，分別記錄品種各異黃酮單體的出峰位置，通過(guò)Agilent 1100檢測(cè)器軟件計(jì)算出樣品種各異黃酮單體的峰面積。

圖3 紅三葉異黃酮提取液與混標(biāo)液擬合度曲線Fig.3 Isoflavone extract of red clover and mixed standard solution fitting curve

2.6.1 4種異黃酮單體標(biāo)準(zhǔn)曲線 4種異黃酮單體的標(biāo)準(zhǔn)曲線（表5），大豆黃素、染料木素、刺芒柄花素、鷹嘴豆芽素 A 的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.996、0.994、0.990、0.995，4種異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系均表現(xiàn)較好。

2.6.2 不同紅三葉品種異黃酮含量分析 3號(hào)紅三葉的異黃酮總量最高，其次為1號(hào)，岷山紅三葉的最低（表6）。不同品種中4種異黃酮單體變化顯著。其中，3號(hào)紅三葉大豆黃素含量顯著高于其他品種，達(dá)到533.03μg/g，分別是2號(hào)及岷山紅三葉的4.9倍和4.06倍；染料木素含量最高的為1號(hào)，達(dá)到1 339.86 μg/g，其次為5號(hào)（1 324.18μg/g），為其余品種的2～3倍；刺芒柄花素含量最高的為3號(hào)紅三葉，達(dá)到4 936.45μg/g，顯著高于其他品種，是含量最低的岷山紅三葉的1.83倍。5號(hào)紅三葉鷹嘴豆芽素A含量最高，為1 827.21μg/g，是含量最低的岷山紅三葉的2.10倍。

表5 異黃酮單體標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 5 Standard curve equation of isoflavones monomer

表6 不同紅三葉品種異黃酮含量分析Table 6 Analysis of isoflavone monomer content of different red clover varieties μg/g

3 討論與結(jié)論

（1）6個(gè)紅三葉品種中，岷山紅三葉的生育期最短，Astred的生育期最長(zhǎng)?？赡芤?yàn)獒荷郊t三葉作為種植多年的當(dāng)?shù)仄贩N，適應(yīng)性較強(qiáng)，生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程較快。其他5個(gè)紅三葉品種均從亞熱帶濕潤(rùn)氣候的澳大利亞昆士蘭州引進(jìn)，對(duì)甘肅蘭州地區(qū)的冷涼干旱氣候尚不適應(yīng)所致。

（2）各參試紅三葉品種中，1號(hào)粗蛋白含量最高；2號(hào)葉莖比高于其他品種；3號(hào)紅三葉異黃酮總量、鮮干比及株高最高；4號(hào)鮮草產(chǎn)量、分枝數(shù)、千粒質(zhì)量?jī)?yōu)于其他品種；5號(hào)小花數(shù)，花序長(zhǎng)最高。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)粗蛋白含量較高的紅三葉品種，其粗纖維含量一般較低，且鮮干比和葉莖比較高。與徐玉鵬等［19］］研究得出牧草中葉莖比高，粗蛋白含量高的品種，粗纖維含量較低的結(jié)果相一致。

（3）試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同紅三葉品種中異黃酮單體含量最高的均為刺芒柄花素，其次為鷹嘴豆芽素A，大豆黃素含量最低。與趙娜等［20］的研究結(jié)果一致。植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物含量的多少取決于植物本身積累這種次生代謝物質(zhì)的能力［21］，說(shuō)明紅三葉積累刺芒柄花素的能力最強(qiáng)，其次為鷹嘴豆芽素A，大豆黃素的積累能力最弱。不同紅三葉品種異黃酮總含量差異顯著，3號(hào)含量最高，其次為1號(hào)，5號(hào)，岷山紅三葉的含量最低。4種異黃酮單體中，3號(hào)的大豆黃素以及刺芒柄花素的含量最高，1號(hào)中染料木素含量最高，5號(hào)中鷹嘴豆芽素A含量最高，說(shuō)明基因型對(duì)4種異黃酮總含量以及單體含量變化影響顯著，與張大勇等［22］的研究結(jié)果一致。5種引進(jìn)紅三葉品種異黃酮總量均高于岷山紅三葉，且異黃酮單體含量最高值并不集中于某一品種，3號(hào)，1號(hào)，5號(hào)均可作為紅三葉異黃酮含量改良的優(yōu)良種質(zhì)來(lái)源。

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于植物黃酮類物質(zhì)的研究主要集中在提取及應(yīng)用方面，關(guān)于異黃酮含量對(duì)植物產(chǎn)量及品質(zhì)影響報(bào)道較少，劉曉玲等［23］研究發(fā)現(xiàn)，抗病植株的主要異黃酮含量較高，感病植株較低，研究發(fā)現(xiàn)異黃酮在人體內(nèi)具有抗氧化作用［24，25］，具體在植物組織中有無(wú)類似作用，有待進(jìn)一步研究。

（4）試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各紅三葉品種優(yōu)良性狀不集中，另外紅三葉為多年生牧草，其生產(chǎn)性能受株齡，抗病性等影響［12］，以后的試驗(yàn)中，應(yīng)結(jié)合株齡、抗性等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以篩選出高產(chǎn)抗病品種。

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