張媛媛，馬暉玲，俞 玲

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

草地早熟禾（Poa pratensis）是一種優(yōu)質(zhì)的冷季型草坪草，主要分布于我國(guó)北方地區(qū)，也是這一地區(qū)需求量最大的建坪草種之一。但草地早熟禾具有生長(zhǎng)緩慢、抗病蟲害能力弱、耐高溫和抗旱能力較差，在高溫干旱的環(huán)境下葉片容易干枯變黃等缺點(diǎn)［1，2］。而草地早熟禾的一些改良品種，如午夜2號(hào)（MidnightⅡ）、新哥來(lái)德（Nuglade）、橄欖球2號(hào)（RugbyⅡ）等具有優(yōu)良特性。其中，午夜2號(hào)的特點(diǎn)為綠期長(zhǎng)、耐低修剪、抗旱耐寒性強(qiáng)、耐熱耐陰性高、耐踐踏、綜合抗病力好；新格萊德耐熱耐陰力出眾、抗病性能高、植株低矮［3］；橄欖球2號(hào)抗寒旱能力強(qiáng)，綠期長(zhǎng)、返青好、抗病蟲害能力強(qiáng)［4，5］。草地早熟禾的3個(gè)品種的綜合評(píng)價(jià)較高，是目前草坪建植中優(yōu)先選擇的優(yōu)異品種，同時(shí)也是良好的育種親本材料。以草地早熟禾午夜2號(hào)、新格萊德和橄欖球2號(hào)為材料，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的研究，為草地早熟禾的品種改良和新品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料由北京克勞沃集團(tuán)提供的草地早熟禾午夜2號(hào)、新格萊德和橄欖球2號(hào)3個(gè)品種的成熟種子為供試材料。

培養(yǎng)基所用的無(wú)機(jī)鹽、蔗糖以及瓊脂為國(guó)產(chǎn)分析純；各種維生素和激素購(gòu)自上海生工生物有限公司，實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外植體處理 取每個(gè)品種的成熟種子適量，分成兩份浸泡于清水，分別放置于4℃冰箱和25±1℃恒溫培養(yǎng)箱中，處理時(shí)間分別為8、16和24h，取出后用清水沖去漂浮的干癟種子并用紗布包裹，然后在超凈工作臺(tái)上先后用70%酒精和0.1%升汞溶液消毒2～10min，無(wú)菌水沖洗3～5次，放置在雙層無(wú)菌濾紙上吸干水分［6］。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng) 將滅菌后的種子按每皿50粒接種于MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基，置于25±1℃、黑暗條件下進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)；6周后，將愈傷組織轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上，每15d繼代1次［18］。附加的激素成分及含量見表1。

1.2.3 分化和植株再生 選取不同繼代次數(shù)且胚性較好的愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基（表1），置于人工氣候箱培養(yǎng)，溫度為25±1℃，16h光照，8h黑暗，光照強(qiáng)度為2 000lx。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

（1）記錄不同處理?xiàng)l件下種子由萌動(dòng)到發(fā)芽再到愈傷組織形成的時(shí)間，計(jì)算平均出愈時(shí)間。

（2）接種約6周（第1次繼代前），統(tǒng)計(jì)各品種不同處理?xiàng)l件下的總愈傷組織塊數(shù)，計(jì)算出愈率。

表1 培養(yǎng)基激素含量Table 1 Hormone levels in the culture medium mg/L

（3）愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基20d后，統(tǒng)計(jì)分化的綠芽數(shù)，并計(jì)算綠芽率。

（4）愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基40d后，記錄成苗數(shù)，并計(jì)算成苗率。

2 結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)做了2種溫度和3個(gè)浸種時(shí)間的預(yù)處理。不同條件處理的草地早熟禾成熟種子的誘導(dǎo)，愈傷組織在出愈時(shí)間和出愈率等方面有明顯差異，而分化和再生過(guò)程差異不大（圖1）。

圖1 4種愈傷組織生長(zhǎng)狀況Fig.1 A Callus induced；B Callus sub－culture；C Green shoot－buds；D Plantlets differentiated

2.1 不同處理對(duì)草地早熟禾種子出愈時(shí)間的影響

浸種時(shí)間相同，4℃下浸種較25℃下浸種，各品種的出愈時(shí)間顯著縮短。而浸種溫度相同條件下，各品種浸種8h較浸種16h和24h的出愈時(shí)間顯著增加，而16h和24h間差異不顯著（表2）。實(shí)驗(yàn)中，在25℃下浸種16h和24h，各品種4～5d萌動(dòng)，7～8d發(fā)芽，平均26.26～38.79d形成愈傷組織，而在4℃下浸種16h和24h，進(jìn)程明顯提前，在16.27～28.95 d即形成愈傷組織，說(shuō)明對(duì)草地早熟禾種子進(jìn)行低溫預(yù)處理能加快出愈時(shí)間，最佳浸種時(shí)間16～24h。

2.2 不同處理對(duì)草地早熟禾出愈率的影響

相同時(shí)間4℃較25℃浸種，各品種愈傷組織誘導(dǎo)率均有所提高（表4），在浸種16h和24h時(shí)，這2個(gè)溫度處理的差異呈顯著水平；相同溫度條件下浸種8h的愈傷組織誘導(dǎo)率均明顯低于16～24h。表明4℃浸種有利于提高草地早熟禾愈傷組織的誘導(dǎo)率，但浸種時(shí)間過(guò)短則不利于誘導(dǎo)愈傷組織。午夜2號(hào)浸種16～24h的愈傷組織誘導(dǎo)率略高，說(shuō)明4℃下浸種16h有利于午夜2號(hào)愈傷組織誘導(dǎo)。新格萊德和橄欖球2號(hào)在4℃下浸種24h的愈傷組織誘導(dǎo)率比浸種16h略高，結(jié)合二者在此條件下的平均出愈時(shí)間，說(shuō)明4℃下浸種24h有利于愈傷組織誘導(dǎo)。

2.3 繼代次數(shù)對(duì)草地早熟禾愈傷組織分化的影響

分別選取繼代1～6次，外表干燥、致密、呈顆粒狀的愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上，每10d繼代1次。約20d愈傷組織出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，40d形成綠苗（圖2）。隨著繼代次數(shù)的增加，草地早熟禾愈傷組織的分化能力逐漸下降。午夜2號(hào)和橄欖球2號(hào)繼代1次的愈傷組織分化能力最高，繼代次數(shù)增加，分化率明顯降低；新格萊德繼代2次的愈傷組織有較強(qiáng)的組織分化能力，隨后愈傷組織分化能力急劇下降。結(jié)果顯示，草地早熟禾繼代培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)越不利于愈傷組織的分化，培養(yǎng)30d以內(nèi)的愈傷組織胚性較好，分化能力強(qiáng)，繼代培養(yǎng)60d以后的愈傷組織分化率明顯降低，基本喪失分化能力。

圖2 繼代培養(yǎng)次數(shù)草地早熟禾愈傷組織的分化Fig.2 Effect of Sub－culture on the callus differentiation of Poa pretensis

3 討論與結(jié)論

3.1 低溫處理對(duì)草地早熟禾愈傷組織誘導(dǎo)的影響

關(guān)于低溫預(yù)處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果不盡相同。劉萍等［7］和廖祥儒等［8］在研究中發(fā)現(xiàn)，低溫處理能夠促進(jìn)小麥成熟胚愈傷組織的形成；但曹原等［9］在研究中指出，低溫預(yù)處理對(duì)愈傷組織形成率的影響取決于植物體的品種；賀杰等［10］在研究中報(bào)道，盡管低溫預(yù)處理對(duì)不同小麥品種愈傷組織誘導(dǎo)率的促進(jìn)效應(yīng)在不同基因型間存在差異，但低溫預(yù)處理有益于多數(shù)品種進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)；1984年McDonnell和Conger［11］的研究表明，種子在4℃下進(jìn)行低溫預(yù)處理可以有效提高肯塔基種子誘導(dǎo)愈傷組織的能力。此次研究發(fā)現(xiàn)，4℃低溫預(yù)處理對(duì)3個(gè)供試草地早熟禾品種愈傷組織的誘導(dǎo)均有促進(jìn)作用，加快了愈傷組織的形成并提高了愈傷組織的誘導(dǎo)率，可能是低溫處理打破種子休眠，提高種子萌發(fā)率，從而提高了其愈傷組織誘導(dǎo)率。因此，低溫預(yù)處理可以廣泛用來(lái)改善草地早熟禾種子愈傷組織形成。

3.2 浸種時(shí)間對(duì)草地早熟禾愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在對(duì)日本結(jié)縷草進(jìn)行研究的結(jié)果表明，用水浸泡處理和綜合處理的方法可以快速有效地促進(jìn)日本結(jié)縷草成熟種子發(fā)芽，并且指出最佳浸泡時(shí)間為72h，但隨著浸泡時(shí)間延長(zhǎng)，種子萌發(fā)率降低，愈傷組織誘導(dǎo)率也相應(yīng)下降［12，13］；賀杰等［10］以小麥種子作為供試材料，研究了不同浸種時(shí)間對(duì)種子出愈率的影響，結(jié)果顯示，16h為最佳浸種時(shí)間，同時(shí)還指出不同品種應(yīng)采取不同浸種時(shí)間。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，浸種8h的種子仍然較硬，很難剝離胚，不利于種子的萌發(fā)，愈傷組織誘導(dǎo)率也處于較低水平；浸種16～24h的種子胚易剝離，種子萌發(fā)率升高，有利于愈傷組織的形成。

3.3 繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)草地早熟禾再生的影響

對(duì)不同基因型早熟禾組織培養(yǎng)和植株再生的研究表明，早熟禾愈傷組織的繼代時(shí)間對(duì)其分化影響較大，隨著愈傷組織繼代培養(yǎng)時(shí)間的增加，其再分化能力顯著下降［11，14］，培養(yǎng)超過(guò)3個(gè)月的愈傷組織基本喪失分化能力［15］。Ke等［14］研究結(jié)果表明，植株再生能力與愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān)，顏色鮮黃、表面干燥、顆粒狀，生長(zhǎng)迅速的愈傷組織為胚性愈傷組織，Armstrong［16］，佘建明等［17］認(rèn)為選擇胚性較好的愈傷組織有利于克服繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)再生能力產(chǎn)生的不良影響。研究結(jié)果顯示，繼代1～2次的愈傷組織保持較高分化能力，繼代3次后愈傷組織分化能力明顯降低，甚至喪失分化能力；不同基因型之間差異顯著，午夜2號(hào)和橄欖球2號(hào)繼代1次的愈傷組織分化能力最強(qiáng)，而新格萊德繼代2次的分化率明顯高于其他培養(yǎng)時(shí)間。

以草地早熟禾3個(gè)品種的成熟種子作為外植體，對(duì)種子作溫度及浸種處理，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，結(jié)果表明4℃浸種16～24h可以促進(jìn)愈傷組織形成，不同品種差異不明顯；對(duì)3個(gè)品種進(jìn)行分化培養(yǎng)，午夜2號(hào)、橄欖球2號(hào)繼代1次的愈傷組織胚性最好，分化能力強(qiáng)，新格萊德繼代2次的胚性愈傷組織分化率最高。為了提高草地早熟禾愈傷組織誘導(dǎo)率并加快出愈時(shí)間，對(duì)種子應(yīng)做4℃低溫預(yù)處理，并且浸泡16～24h為宜；愈傷組織胚性的保持是進(jìn)行植株再生的關(guān)鍵，因此，應(yīng)挑選生長(zhǎng)狀態(tài)最好的愈傷組織進(jìn)行植株再生，此次實(shí)驗(yàn)午夜2號(hào)和橄欖球2號(hào)繼代培養(yǎng)15d、新格萊德繼代培養(yǎng)30d。

［1］呂世海，張偉.亞熱帶氣候區(qū)草地早熟禾品種適應(yīng)性研究［J］.中國(guó)草地，1998（2）：45－47.

［2］李淑珍，王洪晶.我國(guó)草坪業(yè)現(xiàn)狀分析［J］.林業(yè)科技情報(bào)，2005，37（1）：2－4.

［3］申忠寶，王建麗，鐘鵬，等.15個(gè)草地早熟禾品種（系）萌發(fā)期對(duì)鹽脅迫的抗性研究［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（3）：28－30.

［4］董麗華.草地早熟禾不同品種抗性研究［D］.寧夏：寧夏大學(xué)，2005.

［5］藺燕，白淑媛，車少臣.北京地區(qū)冷季型草坪草的品種篩選研究［J］.北京園林，2003，19（64）：31－36.

［6］趙小強(qiáng)，馬暉玲，周萬(wàn)海，等.不同激素濃度和處理方法對(duì)草地早熟禾愈傷組織誘導(dǎo)的影響［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2008，25（5）：92－95.

［7］劉萍，宋曉華，馬惠萍，等.溫度處理對(duì)春小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)率影響初報(bào)［J］.寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1996，17（1）：52－56.

［8］廖祥儒，郭中偉.低溫和PEG預(yù)處理對(duì)小麥愈傷組織形成及IAA氧化的影響［J］.植物學(xué)通報(bào)，2000，17（3）：257－259.

［9］曹原，劉志學(xué)，黃曄俊.冬小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及分化［J］.上海大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，10（5）：503－507.

［10］賀杰，王偉，胡海燕，等.小麥成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（2）：103－105.

［11］Mc Donnell R E，Conger B V.Callus induction and plantlet formation from Mature Embryo Explants of Kentucky bluegrass［J］.Crop Science，1984，24：573－578.

［12］方文娟.日本結(jié)縷草（Zoysia japonica）懸浮再生體系的建立與超低溫保存研究［D］.北京：北京林業(yè)大學(xué)，2008.

［13］劉雅麗，費(fèi)永俊.影響日本結(jié)縷草成熟種子愈傷組織誘導(dǎo)率和出愈時(shí)間的相關(guān)因子研究［J］.長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，7（1）：63－66.

［14］Ke Shangqiang，Chi won W L.Plant Regeneration in Kentucky bluegrass（Poa pratensisL.）Via coleoptiles tissue culture［J］.Plant Cell Report，1996（15）：882－887.

［15］馬忠華，張?jiān)品迹燹D(zhuǎn)祥，等.早熟禾的組織培養(yǎng)和基因槍介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化體系的初步建立［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào)，1999，38（5）：540－544.

［16］Armstrong C L，Green C E.Establishment and maintenance of friable，embryogenic maize callus and the involvement of L－proline［J］.Planta，1985，164：207－214.

［17］佘建明，張寶龍，陳志一，等.草地早熟禾成熟胚離體培養(yǎng)植株再生技術(shù)研究［J］.草地學(xué)報(bào)，2003，11（1）：58－62.

［18］趙小強(qiáng).草地早熟禾原生質(zhì)體培養(yǎng)及體細(xì)胞雜交［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［19］朱根發(fā)，余毓君.草地早熟禾的組織培養(yǎng)條件和分化能力研究［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，13（2）：199－203.

［20］白生軍，馬祥，安惠惠.影響草地早熟禾原生質(zhì)體生長(zhǎng)和分裂的生理生化因素分析［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46（6）：99－103.