沈舒，王瓊，趙鑫，陳彩娟，李友賓

(1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210046;2.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028;3.中國藥科大學，江蘇 南京 210009)

凝血因子Ⅹa(FactorⅩa，FⅩa)是一種絲氨酸蛋白酶，在凝血級聯反應中參與形成凝血酶原復合物(包括FⅩa、FⅤa、凝血酶原以及 Ca2+)，催化凝血酶原轉變?yōu)槟?。凝血酶則促使纖維蛋白原轉變?yōu)槔w維蛋白，激活血小板以及其他凝血因子(FⅤa、FⅤⅢa和FⅩⅢa)，發(fā)揮凝血作用。在凝血級聯反應中，每步酶解過程均具有放大效應，抑制FⅩa，可以在不影響已有凝血酶的情況下減少催化過程中大量產生的凝血酶，既發(fā)揮抗血栓作用，又保證了正常的止血功能［1］，因此，FⅩa成為目前抗血栓治療的重要靶點?；钛鲋兴幱杏凭玫氖褂脷v史和確切的活血功效［2］，通過查閱相關文獻發(fā)現，不少活血化瘀中藥對反映外源性和內源性凝血途徑的凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血酶時間(APTT)同時有延長作用，推測其中可能存在具有抑制FⅩa作用的種類。由此，對18種活血化瘀中藥進行了抑制FⅩa活性的篩選實驗。

1 儀器與材料

NANODROP 1000分光光度計(Thermo，US);梅特勒萬分之一電子天平;Purified FⅩa、生色底物BIOPHEN CS－11(22)(HYPHEN BioMed，批號分別為EZ007K、229015);拜瑞妥(Bayer AG，批號 BXFD8J1);其余試劑均為分析純。藥材于2010年8月購自江蘇省中西醫(yī)結合醫(yī)院中藥房，經江蘇省中醫(yī)藥研究院李友賓博士鑒定，憑證標本存于江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥化學研究室。

2 實驗方法

2.1 樣品制備

將18味中藥飲片粉碎，各稱取5g，加7倍量的甲醇超聲提取2次，每次1h，合并提取液，濃縮成浸膏。用DMSO溶解浸膏，制成50mg/mL的樣品溶液。

2.2 FⅩa活性檢測

反應液包括磷酸鹽緩沖液(pH=8.34，含0.300M NaCl，0.065 0M Na2HPO4，0.001 67M KH2PO4)20μL，FⅩa溶液(2.5μg/mL)20μL，樣品溶液0.2μL，于 37℃溫育30min后加入底物溶液(2.5mg/mL)20μL，開始反應。對照組以溶劑DMSO代替樣品溶液，空白組以緩沖液代替FⅩa溶液。反應開始后分別測量反應體系第0.5～5min在405nm處的吸光度，每0.5min測1次。通過連續(xù)速率法，將所測得的吸光度(A)對時間(T)做回歸曲線，曲線的斜率代表了酶反應的速度，反應了酶的活性，與對照組的回歸曲線斜率相比則可反映抑制劑對酶抑制作用的強弱。

對照組的回歸曲線斜率為Vi，樣品組的回歸曲線斜率為 V0，樣品的抑制率(I%)=(Vi－ V0)/Vi［2－3］。

表1 各活血化瘀中藥對FⅩa的抑制作用(n=2)

3 結果與討論

18種活血化瘀中藥抑制FⅩa活性的實驗結果見表1?？梢钥闯鏊Y選的18種活血化瘀中藥提取物在50mg/ml的濃度下，有6種對FⅩa的抑制活性超過50%，4種抑制活性超過30%，其它種類則抑制作用較弱。目前世界各國許多科學家致力于尋找高效、低毒、專一、可口服的FⅩa抑制劑，主要以合成的小分子化合物為主［4－5］，也有從嗜血性無脊椎動物體內分離到多肽類物質［6］。中醫(yī)學運用活血化瘀藥治療血瘀證有上千年的歷史，從中尋找高效低毒專一的FⅩa抑制劑具有很大優(yōu)勢。我們正在對其中的幾種中藥進一步分離純化，以期獲得對FⅩa抑制活性較強的單體化合物。

［1］Roehrig S，Straub A，Pohlmann J，et al.Discovery of the novel antithrombotic agent 5－Cholro－N－({(5S)－2－oxo－3－［4－(3－oxomorpholin－4－yl)phenyl］－1，3－oxazolidin－5－yl}methyl)thiophene－2－carboxamide(BYA 59－7939):An oral，direct Factor Ⅹa inhibitor［J］.J Med Chem，2005，48，5900－5908.

［2］高忠明.活血化瘀中藥協同治療腦梗死的臨床療效觀察［J］.中醫(yī)藥學報，2011，39(2):47－50.

［3］李潔璇，張曉雪，王銀葉.新型多肽bg11522體外對活化凝血因子Ⅹ的抑制作用［J］.中國新藥雜志，2008，17(8):656－660.

［4］Chu V，Brown K，Colussi D，et al.In vitrocharacterization of a novel Factor Ⅹa inhibitor，RPR 130737［J］.Thromb Res，2000，99(1):71－82.

［5］劉曉，崔一民.新型抗凝血藥物—利伐沙班［J］.中國藥房，2010，21(1):83－85.

［6］Kaiser B.DX－9065a，a Direct Inhibitor of FactorⅩa［J］.Cardiovascular Drug Reviews，2003，21(2):91－104.

［7］蔣香梅.嗜血性無脊椎動物的天然凝血因子Ⅹa抑制物［J］.動物醫(yī)學進展，2006，27(1):31－35.