汪先丁，劉 敏，高 鵬，丁 文，高 強，孫 群,*

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室， 四川 成都 610064；2.四川省原子能研究院，四川 成都 610101)

郫縣豆瓣自然發(fā)酵過程中真菌群落的演替及黃曲霉毒素B1的消長

汪先丁1，劉 敏1，高 鵬2，丁 文1，高 強1，孫 群1,*

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室， 四川 成都 610064；2.四川省原子能研究院，四川 成都 610101)

以四川省郫縣豆瓣為研究對象，運用PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)研究豆瓣自然發(fā)酵過程中真菌群落的演替，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測豆瓣樣品中黃曲霉毒素B1(AFB1)含量。結(jié)果表明：郫縣豆瓣自然發(fā)酵過程中的優(yōu)勢真菌有米曲霉(Aspergillus oryzae)、淀粉絲菌(Amylomyces rouχii)、米根霉(Rhizopus oryzae)、異常畢赤酵母(Pichia anomala)、漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)的近緣種，其中米曲霉是制曲階段和發(fā)酵初期的優(yōu)勢真菌，淀粉絲菌和米根霉是制曲階段的優(yōu)勢真菌，異常畢赤酵母和漢遜德巴利酵母是發(fā)酵初期的優(yōu)勢真菌。各發(fā)酵時間點樣品的AFB1含量均低于國標(biāo)(5μg/kg)；在制曲和發(fā)酵初期階段，AFB1的含量均不斷增加，但在第14天后趨于穩(wěn)定。因此，對AFB1的含量生物防治可重點集中在制曲階段。

郫縣豆瓣；PCR-DGGE；真菌群落；ELISA；AFB1

川菜作為中國四大菜系之一，以其色香味形俱佳而享譽全國，這與作為川菜主要調(diào)味料的豆瓣的烹調(diào)作用是分不開的，其中具有三百多年的生產(chǎn)歷史、獨樹一幟的釀造工藝和得天獨厚的釀造地理環(huán)境的郫縣豆瓣因味辣香醇、紅棕油亮、黏稠絨實、醬香濃郁等優(yōu)點廣受消費者青睞，堪稱川菜之魂[1]。

郫縣豆瓣以優(yōu)質(zhì)的蠶豆和辣椒為主要原料，經(jīng)自然發(fā)酵而成的半流動黏稠體或半固態(tài)調(diào)味品。郫縣豆瓣自然發(fā)酵過程一般包括發(fā)酵制曲階段、發(fā)酵初期、發(fā)酵后期3個階段，發(fā)酵中有多種微生物參與，主要有霉菌、酵母和乳酸菌，且微生物群落演替主要發(fā)生在發(fā)酵制曲階段和發(fā)酵初期[2]。真菌在豆瓣自然發(fā)酵中發(fā)揮非常重要的作用。在制曲階段，霉菌能夠分泌蛋白酶、肽酶、淀粉酶、糖化酶等多種酶，其中蛋白酶和肽酶將原料中蛋白質(zhì)分解成多肽及多種氨基酸；淀粉酶系把淀粉轉(zhuǎn)化成葡萄糖、雙糖、三糖等；這些氨基酸和糖類不僅是豆瓣風(fēng)味的來源，而且為后階段其他微生物的生長創(chuàng)造條件。在發(fā)酵初期，酵母將糖發(fā)酵成酒精和二氧化碳，酒精既參與酯類的合成，也能被氧化成有機酸類，在豆瓣風(fēng)味形成中發(fā)揮重要作用。自然發(fā)酵豆瓣醬醅中也存在一些對豆瓣品質(zhì)有不良影響的真菌，如毛霉和青霉能產(chǎn)生霉臭味，影響豆醬的風(fēng)味，產(chǎn)毒黃曲霉和寄生曲霉還可產(chǎn)生黃曲霉毒素B1(AFB1)，其具有強烈的致癌、致畸和致突變作用，是重大食品安全隱患，因此對豆瓣發(fā)酵過程中的AFB1的檢測和監(jiān)控就顯得非常重要。此外，細(xì)菌在豆瓣自然發(fā)酵中也發(fā)揮著重要的作用，在豆瓣發(fā)酵過程中乳酸菌產(chǎn)生的有機酸與酵母產(chǎn)生的酒精形成酯類物質(zhì)，增添豆瓣的風(fēng)味，同時還能抑制一些雜菌的生長[3]。張琦等[4]通過研究發(fā)現(xiàn)郫縣豆瓣自然發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化較明顯，乳酸菌和Staphylococcus χylosus是發(fā)酵中的優(yōu)勢細(xì)菌，其中Lactobacillus plantarum是制曲階段和發(fā)酵初期的優(yōu)勢細(xì)菌，Weissella confusa和Leuconostoc lactis是發(fā)酵初期的優(yōu)勢菌并非常少量地存在于制曲階段，Lactobacillus namurensis在發(fā)酵后期占優(yōu)勢，S. χylosus在整個發(fā)酵中占優(yōu)勢，而一些培養(yǎng)細(xì)菌克隆卻交替出現(xiàn)在不同發(fā)酵階段。

近年來聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCRDGGE)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物區(qū)系的研究中。2000年，Omar等[5]利用DGGE對墨西哥發(fā)酵面團(tuán)(Pozol)發(fā)酵過程中的微生物種群動力學(xué)進(jìn)行了研究，Meroth等[6]將 DGGE 技術(shù)用于研究酸面團(tuán)發(fā)酵過程中酵母群落的動態(tài)，Kim等[7]使用DGGE研究了一種韓國發(fā)酵黃豆醬(Doenjang)中的微生物群落。目前對郫縣豆瓣中的微生物研究主要還是采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的研究方法，采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對郫縣豆瓣中微生物區(qū)系的研究報道還是很少。

迄今為止，黃曲霉毒素分析法主要有薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)、免疫層析(IC)等，ELISA法是在免疫學(xué)和細(xì)胞工程學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種微量檢測技術(shù)，該方法快速、靈敏、特異性強、成本較低，特別適合于對AFB1污染檢測控制中大量樣品的篩查[8]。

本研究采用PCR-DGGE技術(shù)對郫縣豆瓣自然發(fā)酵過程中真菌群落進(jìn)行分析，以期揭示郫縣豆瓣自然發(fā)酵過程中真菌種群的動態(tài)變化，同時采用ELISA法檢測不同發(fā)酵時間點發(fā)酵物中AFB1含量，并探討豆瓣發(fā)酵中AFB1含量的消長與真菌種群動態(tài)變化之間的相關(guān)性，為豆瓣發(fā)酵中黃曲霉的生物防治提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

郫縣豆瓣，由四川郫縣豆瓣廠提供。

依據(jù)郫縣豆瓣的生產(chǎn)工藝，在豆瓣自然發(fā)酵過程按發(fā)酵進(jìn)程依次取樣，分別取得發(fā)酵1、4、7、14、30d的豆瓣作為研究材料，其中1、4、7d屬于制曲階段；14d和30d屬于發(fā)酵初期。

氯仿、異戊醇、乙醇、十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺、甲叉雙丙稀酰胺、Tris堿、尿素、甲酰胺博瑞克生物技術(shù)公司；引物 英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司；Taq DNA Polymerase、dNTPs 寶生物工程(大連)有限公司；AFB1酶聯(lián)免疫定量測試盒 江蘇省蘇微微生物研究有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DcodeTM通用突變檢測體系、S1000TMThermal Cycler、Bio凝膠成像系統(tǒng)、PowerPac基礎(chǔ)電泳儀電源、Model 680酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；ST-02A型多功能粉碎機 永康市帥通工具有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生產(chǎn)工藝流程

制曲階段(約7d)：葫豆脫殼→漂燙→冷卻→拌入面粉→入曲房制曲→豆瓣成曲；加入30%～40%鹽水后攪拌混勻，進(jìn)入發(fā)酵初期階段：保溫發(fā)酵→成熟瓣子；加入腌制辣椒醅，進(jìn)入發(fā)酵后期：混和發(fā)酵→成熟豆瓣。

1.3.2 豆瓣樣品中真菌總DNA的提取

室溫解凍后稱取25g豆瓣樣品，浸于0.1g/100mL 225mL滅菌蛋白胨水中，于搖床上180r/min 振搖30min，制成10%菌懸液。采用改良的CTAB法[9]并結(jié)合玻璃珠振蕩破碎細(xì)胞壁提取樣品中真菌總DNA，經(jīng)RNase純化后作為后續(xù)PCR反應(yīng)的模板。

1.3.3 PCR-DGGE分析

以純化后的真菌總DNA為模板，選用帶GC clamp (CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G)真菌通用引物GC-FF390 (5＇-GC Clamp-CGATAACGAACGAGACCT-3＇)和FR1(5＇-AICCATTCA ATCGGTAIT-3＇)[10]擴增18S rDNA的部分序列。PCR反應(yīng)體系為50μL：10×Buffer 5μL、2.5mmol/L dNTP 4μL、25mmol/L MgCl23μL、Taq DNA聚合酶0.25μL、上下游引物各1μL、ddH2O 31.75μL、模板DNA 4μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，52℃退火45s，72℃延伸30，35個循環(huán)；72℃延伸7min。擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖電泳檢測。

變性梯度凝膠電泳(DGGE)：對真菌18S rDAN的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE，PCR產(chǎn)物上樣于7%的聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為30%～60%(100%的變性劑含有7mol/L尿素和40%甲酰胺)， 在1×TAE緩沖液中，60℃、80V恒溫、恒壓下電泳14h。電泳結(jié)束后，將DGGE膠用SYBR Green I (1×TAE，1:10000)染色，共染3次，每次15min，之后將DGGE膠片在Bio凝膠成像系統(tǒng)下拍照，圖像用Quantity one (Bio-Rad)軟件進(jìn)行分析。

代表性條帶切膠回收、測序：對DGGE圖譜中代表性條帶切膠回收，加入40μL TE緩沖液4℃浸泡過夜，離心后取上清為模板，用不含GC clamp的引物FF390和FR1再次擴增18S rDNA區(qū)，反應(yīng)體系和程序同上。PCR產(chǎn)物純化后送上海Invitrogen生命技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果提交NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行Blast 相似序列檢索，并于GenBank上獲得序列登錄號。

1.3.4 DGGE指紋圖譜的聚類分析

采用Quantity one軟件對豆瓣樣品中真菌群落的DGGE指紋圖譜進(jìn)行聚類分析，聚類圖是基于DGGE圖譜中各泳道之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)，采用非加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類。

1.3.5 AFB1的檢測

采用ELISA法檢測，具體的提取方法(包括豆瓣樣品的前處理)參照AFB1酶聯(lián)免疫定量測試盒中的說明書進(jìn)行，每個樣品進(jìn)行3次測定，取濃度的平均值。

1.4 統(tǒng)計分析

使用Microsoft Office Excel 2003和IBM SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于18S rDNA的PCR-DGGE技術(shù)分析豆瓣發(fā)酵過程中真菌群落的動態(tài)變化

DGGE指紋圖譜上的一個條帶代表一個微生物類群(分類水平可達(dá)種)，條帶數(shù)越多說明微生物多樣性越豐富[11]。條帶染色后的熒光強度反映該菌的相對豐富度；條帶信號越亮，表示該菌數(shù)量相對越多。

郫縣豆瓣自然發(fā)酵過程中的不同時期樣品中的真菌18S rDNA PCR-DGGE指紋圖譜見圖1，其代表性條帶的測序結(jié)果見表1。如圖1所示，在制曲階段(1～7d)，真菌條帶較多，且優(yōu)勢種條帶較明顯；在發(fā)酵前期，真菌條帶較制曲階段減少，部分條帶有所變暗，但在14～30d的發(fā)酵過程中，條帶強度有增大趨勢。代表性條帶的測序結(jié)果顯示，發(fā)酵中主要真菌有淀粉絲菌(Amylomyces rouχii)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、米根霉(Rhizopus oryz ae)、異常畢赤酵母(Pic hia anomala)、漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)的近緣種。條帶1、4在1、4、7d的豆瓣樣品中很明亮，在發(fā)酵初期(14、30d)樣品中其亮度變??；條帶1、4分別為A. rouχii和 R. oryzae的近緣種。A. rouχii是南亞、中國和印度的傳統(tǒng)發(fā)酵食品中添加的種曲的主要成分之一[12]。R.oryzae產(chǎn)淀粉酶活力很強，除糖化作用外，可產(chǎn)生少量乙醇、乳酸、反丁烯二酸及大量的丁烯二酸[13]。條帶2是整個發(fā)酵過程的優(yōu)勢種條帶，在發(fā)酵過程中其亮度一直很大，條帶2為A.oryzae的近緣種；在制曲階段，A.oryzae在豆瓣子上生長繁殖，產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶等多種酶，蛋白酶將蛋白質(zhì)水解為各類氨基酸，淀粉酶將淀粉水解為糖類物質(zhì)，為其他微生物提供必要的營養(yǎng)[14]。條帶3在發(fā)酵過程中逐漸變暗，其為Absidia corymbifera近緣種。條帶5在4d的樣品中存在，隨后消失，但在30d的樣品又出現(xiàn)，條帶5為P. anomala近緣種。條帶6在4d樣品中最明亮，在發(fā)酵初期，條帶6的亮度逐漸變大，條帶6為D. hansenii近緣種。D. hansenii是一種在食品尤其是奶制品中經(jīng)常出現(xiàn)的酵母，它能在高鹽濃度下產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶[15]。Kim等[7]發(fā)現(xiàn)D. hansenii是韓國黃豆醬(Doenjang)中最普遍的真菌之一。條帶7和8僅存在1、4、7d的樣品中，分別為Mucor genevensis和Aspergillus flavus近緣種。條帶9微弱存在發(fā)酵1、7、1 4 d的樣品中，鑒定為Aspergillus sojae的近緣種。條帶10、11較弱地存在于1、7、14、30d的樣品中，條帶10為Zygosaccharomyces rouχii近緣種。Z. rouχii是一種耐鹽酵母，在發(fā)酵大豆醬香氣的產(chǎn)生中發(fā)揮非常重要的作用，它能產(chǎn)生異戊醇、戊醇、異丁醇等豆醬中重要風(fēng)味物質(zhì)[16]。條帶11為Metschnikowia pulcherrima的近緣種。

圖1 豆瓣發(fā)酵各階段真菌群落DGGE指紋圖譜Fig.1 DGGE fingerprints of fungal community in horsebean paste at different fermentation stages

表1 圖1中DGGE條帶的鑒定Table 1 Identification of DGGE bands in Fig. 1

2.2 DGGE指紋圖譜的聚類分析

圖2 豆瓣真菌群落DGGE指紋圖譜聚類分析Fig.2 Cluster analysis of DGGE fingerprints of fungal community in horsebean paste

UPGMA聚類分析旨在評估不同發(fā)酵時間點豆瓣樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)的相似性，采用皮爾森相關(guān)系數(shù)計算相似度。由圖2可知，5個時間點的樣品分成2組：組1 (1、4、7d樣品)和組2 (14、30d樣品)，發(fā)酵1d和7d樣品的相似性為82%，發(fā)酵14d和30d樣品的相似性為63%，制曲階段樣品組1和發(fā)酵初期階段樣品組2的相似性只有46%。DGGE指紋圖譜聚類分析結(jié)果表明，不同發(fā)酵階段樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)相似性較低，同一發(fā)酵階段樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)相似性較大。

2.3 AFB1在豆瓣發(fā)酵過程中的消長規(guī)律

圖3 豆瓣樣品中黃曲霉毒素B1的含量Fig.3 AFB1 concentration of horsebean paste samples

由圖3可知，在整個豆瓣發(fā)酵過程中AFB1含量均未超過國標(biāo)(5μg/kg)。在制曲階段，AFB1含量迅速增加，由第1天的(1.235±0.079)μg/kg增加到第7天的(2.602±0.156)μg/kg (P＜0.05)；從第8天開始進(jìn)入發(fā)酵初期階段后，AFB1含量隨發(fā)酵時間延長有所增加(P＜0.05)，但在第14天后趨于穩(wěn)定(P＞0.05)。直至檢測的第30天。但在實際生產(chǎn)工藝中，由于在制曲階段結(jié)束時(第8天)一般都要添加30%～40%的鹽水后才進(jìn)入發(fā)酵初期，故按單位質(zhì)量計的發(fā)酵物中AFB1含量實測值是變低了。

在DGGE指紋圖譜中，代表黃曲霉菌(A. flavus)的條帶8在制曲階段一直較弱地存在，但在發(fā)酵初期消失了，表明A. flavus數(shù)量減少了，這可能是發(fā)酵階段AFB1含量趨于穩(wěn)定的原因。自然界中有多種微生物包括乳酸菌、芽孢桿菌、酵母等能抑制黃曲霉的生長和產(chǎn)毒[17]。Huass等[18]研究發(fā)現(xiàn)腐生型酵母，如假絲酵母屬(Candia sp.)和畢赤酵母屬(Pichia sp.)的一些種能夠在很大程度上抑制黃曲霉生長。對有傷口的阿月渾子堅果噴灑了P.anomala酵母后，相比于對照組，A.flavus孢子數(shù)減少了77%～99%，A.flavus的定殖減少了3～5倍[19]。本研究中，對應(yīng)P.anomala的條帶5在發(fā)酵4d和30d的樣品中非常明亮，表明P.anomala在這兩個時間點樣品的數(shù)量相對較多，這與A.flavus的數(shù)量變化和AFB1含量的變化趨勢基本符合。此外，條帶11代表的M.pulcherrima在發(fā)酵初期樣品中一直存在，但其數(shù)量在14d樣品中相對更大。M.pulcherrima是一種具有高效生物控制能力的酵母。Turkel等[20]研究發(fā)現(xiàn)M.pulcherrima的3種分離株對一些人類致病菌Proteus vulgaris、Escherichia coli及A. flavus、Aspergillus fumigatus具有有效的拮抗作用。P.anomala和M.pulcherrima在豆瓣中的存在可能對A.flavus的生長有抑制作用。Khanafari等[21]發(fā)現(xiàn)接種在玉米上的L. plantarum能很大程度上抑制A.flavus孢子的生長，并具有一定降解AFB1的能力。Lavermicocca等[22]研究表明分離自小麥粉水解液中的L.plantarum的培養(yǎng)液能抑制A.flavus的生長。先前研究表明L.plantarum是豆瓣自然發(fā)酵過程中制曲階段和發(fā)酵初期的優(yōu)勢細(xì)菌，因此，認(rèn)為在豆瓣自然發(fā)酵中L.lantarum可能與P.anomala和M.pulcherrima共同抑制了A. flavus的生長，進(jìn)而影響了豆瓣發(fā)酵過程中AFB1含量的變化。

3 結(jié) 論

郫縣豆瓣自然發(fā)酵過程中真菌群落發(fā)生了一定的演替，米曲霉在整個發(fā)酵制曲和發(fā)酵初期均占優(yōu)勢，其他多數(shù)霉菌在發(fā)酵制曲階段占優(yōu)勢，而酵母多作為優(yōu)勢真菌存在于發(fā)酵初期。在豆瓣發(fā)酵過程中，AFB1主要產(chǎn)生在制曲階段，因此對黃曲霉的生物防治可集中在制曲階段。

參考文獻(xiàn)：

[1]李幼筠. 郫縣豆瓣,,剖析[J]. 中國釀造, 2008(11): 83-86.

[2]張淼, 何江紅, 賈洪鋒, 等. 四川豆瓣加工工藝及風(fēng)味物質(zhì)研究進(jìn)展[J]. 食品與發(fā)酵科技, 2011, 47(1): 35-38.

[3]劉超蘭, 黃著, 彭熙敏, 等. 乳酸菌和酵母共培養(yǎng)技術(shù)縮短郫縣豆瓣醬陳釀期的應(yīng)用研究[J]. 中國釀造, 2009(3): 105-108.

[4]張琦, 汪先丁, 楊虎, 等. 郫縣豆瓣自然發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化[J]. 食品與發(fā)酵科技, 2010, 46(6): 16-18.

[5]OMAR N B, AMPE F. Microbial community dynamics during production of the Mexican fermented maize dough pozol[J]. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(9): 3664-3673.

[6]MEROTH C B, HAMMES W P, HERTEL C. Identification and population dynamics of yeasts in sourdough fermentation processes by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis[J]. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(12): 7453-7461.

[7]KIM T W, LEE J H, KIM S E, et al. Analysis of microbial communities in doenjang, a Korean fermented soybean paste, using nested PCR-denaturing gradient gel electrophoresis[J]. International Journal of Food Microbiology, 2009, 131(2/3): 265-271.

[8]TRUCKSESS M W, STACK M E, NESHEIM S, et a1. Enzymelinked immunosorbent assay of aflatoxins B1, B2 and G1 in corn, cottonseed, peanuts, peanut butter, and poultry feed: collaborative study [J]. JAOAC Int, 1989, 72(6): 957-962.

[9]程志學(xué), 陳清華, 于遠(yuǎn), 等. 適合AFLP 分析用的節(jié)瓜基因組DNA 提取方法的研究[J]. 分子植物育種, 2009, 7(2): 420-424.

[10]VAINIO E J, HANTULA H. Direct analysis of wood-inhabiting fungi using denaturing gradient gel electrophoresis of amplified ribosomal DNA[J]. Mycol Res, 2000, 104(8): 927-936.

[11]朱海霞, 陳林海, 張大偉, 等. 活性污泥微生物菌群研究方法進(jìn)展[J].生態(tài)學(xué)報, 2007, 27(1): 314-322.

[12]HESSELTINE C W, ROGERS R, WINARNO F G. Microbiological studies on amylolytic oriental fermentation starters[J]. Mycopathologia, 1988, 101(3): 141-155.

[13]張金蘭, 魯緋, 紀(jì)鳳娣, 等. 大豆發(fā)酵食品中根霉的研究進(jìn)展[J]. 中國釀造, 2010, 222(9): 1-4.

[14]闞建全. 食品化學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2002: 256-274.

[15]DOLCI P, BARMAZ A, ZENATO S, et al. Maturing dynamics of surface microflora in Fontina PDO cheese studied by culture-dependent and -independent methods[J]. Journal of Applied Microbioloy, 2009, 106: 278-287.

[16]JANSEN M, VEURINK J H, VEURINK, et al. Growth of the salt-tolerant yeast Zygosaccharomyces rouχii in microtiter plates: ects of NaCl, pH and temperature on growth and fusel alcohol production from branched-chain amino acids[J]. FEMS Yeast Research , 2003, 3(3): 313-318.

[17]劉付香, 李玲, 梁炫強. 生物防治黃曲霉毒素污染研究進(jìn)展[J]. 中國生物防治, 2010, 26(1): 96-101.

[18]HUASS T, BAKER J L, FLORES-ESPIRITU M. Interactions of saprophytic yeasts with a nor mutant of Aspergillus flavus[J]. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(6): 2738-2740.

[19]HUASS T. Application of a yeast, Pichia anomala strain WRL-076 to control Aspergillus flavus for reducing aflatoxin in pistachio and almond [J]. Management of Plant Diseases and Arthropod Pests by BCAs IOBC/ wprs Bulletin, 2004, 27(8): 291-294.

[20]TURKEL S, ENER B. Isolation and characterization of newpulcherrima strains as producers of the antimicrobial pigment pulcherrimin[J]. Zeitschrift fur Naturforschung, Section C, Biosciences, 2009, 64(5/6): 405-410.

[21]KHANAFARI A, SOUDI H, MIRABOULFATHI M. Biocontrol of Aspergillus flavus and aflatoxin B1 production in corn[J]. Iranian Journal of Environmental Health Science & Engineering, 2007, 4(3): 163-168.

[22]LAVERMICOCCA P, VALERIO F, EVIDENTE A, et al. Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21B[J]. Appl Environ Microb, 2000, 66 (9): 4084-4090.

Succession of Fungal Microflora and Change of Aflatoxin B1during Fermentation of Pixian Horsebean Paste

WANG Xian-ding1，LIU Min1，GAO Peng2，DING Wen1，GAO Qiang1，SUN Qun1,*
(1. Key Laboratory of Bio-resource and Bio-environment, Ministry of Education, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China；2. Sichuan Institute of Atomic Energy, Chengdu 610101, China)

The succession of fungal microflora and the change of aflatoxin B1(AFB1) during natural fermentation of Pixian horsebean paste were investigated using PCR-DGGE and ELISA analysis. The results showed that Aspergillus oryzae, Amylomyces rouχii, Rhizopus oryzae, Pichia anomala, and Debaryomyces hansenii were dominant during natural fermentation of Pixian horesebean paste, with A. oryzae as the predominant strain at both the starter propagation stage and incipient fermentation stage. A. rouχii and R. oryzae were the dominant strains during the starter propagation stage, while P. anomala and D. hansenii were the dominant strains during the incipient fermentation stage. The amount of AFB1in all samples was less than the GB standard of 5 μg/kg. During the starter propagation and incipient stages, AFB1 concentration revealed a gradual increase and then kept stable after the 14thday. Accordingly, more attention should be paid to the starter propagation stage for the biological control of AFB1.

Pixian horsebean paste；PCR-DGGE；fungal microflora；ELISA；AFB1

TS201.3

A

1002-6630(2012)11-0142-05

2011-06-26

國家科技人員服務(wù)企業(yè)行動項目(2009GJF00039)；四川省科技支撐計劃項目(2010NZ0051)；國際原子能機構(gòu)(IAEA)支持項目(16356/R0)

汪先丁(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為食品安全和食品微生物。E-mail：wangxianding@yahoo.cn

*通信作者：孫群(1967—)，女，教授，博士，研究方向為食品微生物學(xué)和微生物技術(shù)。E-mail：qunsun@scu.edu.cn