張澤生，賀 偉，劉甜甜，史 珅,2，李 森

(1.食品營養(yǎng)與安全省部共建教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津 300457；2.天獅集團有限公司博士后工作站，天津 301700)

白藜蘆醇的體外抗氧化活性

張澤生1，賀 偉1，劉甜甜1，史 珅1,2，李 森1

(1.食品營養(yǎng)與安全省部共建教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津 300457；2.天獅集團有限公司博士后工作站，天津 301700)

通過對DPPH自由基、ABTS＋·的清除能力和還原力的測定，探討白藜蘆醇的抗氧化活性；并采用過氧化氫誘導紅細胞自氧化模型和肝組織脂質(zhì)過氧化反應模型，探討白藜蘆醇對自由基損傷和脂質(zhì)過氧化反應的抑制作用。結(jié)果顯示，白藜蘆醇具有很強的清除自由基和抑制自由基引起的氧化損傷的能力。

白藜蘆醇；抗氧化；DP P H自由基；ABTS＋·；還原力；脂質(zhì)過氧化

白藜蘆醇是蒽醌萜類化合物，主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中，結(jié)構(gòu)與合成的雌激素類化合物己烯雌酚類似，被認為是一種植物雌激素[1]。近年，白藜蘆醇因其具有的諸如抗腫瘤[2-6]、抗輻射[7]、保護心血管[8-10]、保肝護肝[11-12]等廣泛的生物學活性，而備受研究者關(guān)注。采用DPPH自由基、ABTS＋·的清除能力及還原力的測定實驗，研究白藜蘆醇對自由基的清除能力，并分別選用紅細胞氧化和肝組織體外氧化模型，探討其對氧化損傷的抑制作用，旨在為白藜蘆醇作為抗氧化保健食品的深入研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、動物與試劑

白藜蘆醇由天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司提供；小鼠，IC R，SPF級，雄性，1 8～2 2 g。

ABTS、DPPH 美國Sigma公司；其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

J-E冷凍離心機 美國Beckman公司；AB204-N分析天平 日本島津公司；SP-2102UV分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白藜蘆醇清除DPPH自由基能力的測定

DPPH用于抗氧化物質(zhì)的研究方法由Blois等[13]首次提出，本研究中，白藜蘆醇對DPPH自由基的清除能力的測定在此基礎(chǔ)上參照Brand-William等[14-15]的方法，結(jié)合Yamagnchi等[16]的研究方法進行改良。選取VC與BHT作為對照樣品以乙醇為溶劑，分別配制不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，取0.1mL樣液同1.0mL DPPH乙醇溶液混勻，乙醇溶液為空白樣液，于37℃反應60min后在波長517nm比色，DPPH自由基清除率采用公式(1)計算。

式中：A樣品為517nm波長處不同質(zhì)量濃度樣品的吸光度；A空白為517nm波長處空白管的吸光度。

1.3.2 白藜蘆醇清除ABTS＋·能力的測定

采用Trolox等價抗氧化能力法對白藜蘆醇清除ABTS＋·的能力進行測定，參照Miller等[17]和Rice-Evans 等[18]的研究方法，先配制濃度為2.45mmol/L的ABTS＋·儲備液，臨用時用無水乙醇稀釋得到ABTS＋·工作液(30℃，734nm波長處吸光度為0.70±0.02)。以VC和BHT作為陽性對照，按照公式(2)計算ABTS＋·的清除率。

1.3.3 白藜蘆醇還原力的測定

取樣品1mL溶于水配成25～100μg/mL，加pH6.6、2.5mL 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液和2.5mL 1g/100mL K3Fe(CN)6溶液混勻后50℃水浴20min，迅速冷卻，然后加入2.5mL10g/100mL三氯乙酸，5000r/min離心10min，取上清2.5mL 加2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1g/100mL三氯化鐵，混合后在700nm測定吸光度。實驗采用BHT和VC作為對照品。

1.3.4 白藜蘆醇對H2O2引起的小鼠紅細胞氧化溶血的影響

取健康小鼠，眼底靜脈叢取血，1mg/mL肝素鈉抗凝，0.9g/100mL NaC1溶液洗滌3次，制成0.5%的紅細胞懸液。取該紅細胞懸液1mL，加入到各試管，根據(jù)后面加入試劑的不同可分為空白管、對照管、測試管：測試管是分別加入不同質(zhì)量濃度樣品0.2mL，對照管和空白管則加0.2mL生理鹽水，搖勻。對照管和測試管加100nmol/mL H2O20.2mL啟動反應，同時對照管補充0.2mL蒸餾水。37℃水浴1h，取出用生理鹽水稀釋6倍，2500r/min離心10min，取上清于415nm波長處測定吸光度。按照式(3)計算紅細胞溶血抑制率。

式中：A0為對照組吸光度；A1為加樣品組吸光度；A為H2O2誘導組吸光度。

1.3.5 白藜蘆醇對小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化作用的影響

取正常小鼠禁食過夜，次日處死，迅速取出肝臟，置4℃生理鹽水中反復漂洗，剔除脂肪及結(jié)締組織，用濾紙吸干水分，稱質(zhì)量，然后剪碎，勻漿，后在冰浴條件下用生理鹽水制成10%的組織勻漿，所得勻漿5000r/min離心10min，取上清液備用。

分別取1mL 5% 的新鮮肝組織勻漿液，加入1mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，每個質(zhì)量濃度的樣品管均為待測管，對照管加1mL生理鹽水，置于37℃水浴1h，取出后加入1mL的15g/100mL的三氯乙酸終止反應，再加0.67g/100mL TBA 1mL，混勻后置于沸水浴中加熱15min，流水冷卻，以3000r/min離心10min，除去蛋白質(zhì)沉淀后，取上清液與532 nm波長處測定丙二醛MDA-TBA復合物的吸光度，BHT作陽性對照，待測樣品的抗氧化活性以抑制率表示。

式中：A為對照管吸光度；A1為待測管吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇清除DPPH自由基的能力

圖1 白藜蘆醇清除DPPH自由基的能力Fig.1 DPPH radical scavenging capacity of resveratrol

由圖1可知，白藜蘆醇在62.5～1000μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)隨質(zhì)量濃度的遞增，清除率也呈逐漸增強的趨勢，質(zhì)量濃度達到1000μg/mL時，清除率超過82%；在62.5μg/mL時，其清除率超過對照樣VC及BHT，在125μg/mL時，其清除DPPH自由基能力仍略強于BHT。

2.2 白藜蘆醇清除ABTS＋·的能力

圖2 白藜蘆醇清除ABTS＋·的能力Fig.2 ABTS radical scavenging capacity of resveratrol

由圖2可知，白藜蘆醇在2～250μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)隨質(zhì)量濃度遞增，清除自由基能力增強的趨勢，在2～62.5μg/mL范圍內(nèi)增強趨勢最強，質(zhì)量濃度進一步增大時趨勢變緩，當樣品質(zhì)量濃度達250μg/mL時，清除率超過92%；在低于25.6μg/mL時，其清除率超過對照樣VC及BHT，在31.5μg/mL時，其清除DPPH自由基能力仍強于BHT。

2.3 白藜蘆醇的還原力

由圖3可知，白藜蘆醇在質(zhì)量濃度3～200μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)隨質(zhì)量濃度遞增，還原力呈現(xiàn)逐漸增強的趨勢；在質(zhì)量濃度低于25μg/mL時，其還原力超過對照樣VC。

圖3 白藜蘆醇的還原力Fig.3 Reducing power of resveratrol

有研究者[19]認為白藜蘆醇具有很強的清除自由基的能力，本研究通過體外化學實驗發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇的在體外抗氧化能力很強，并且在較低質(zhì)量濃度時其清除自由基的能力較VC等強氧化劑更強。

2.4 白藜蘆醇對過氧化氫引起的小鼠紅細胞氧化溶血的影響血紅細胞是機體一類重要的功能性細胞，大量存在于人和動物的外周血中，主要承擔機體運輸氣體，尤其是氧氣的責任。Nagababu等[20]發(fā)現(xiàn)血紅細胞在過氧化氫誘導或自發(fā)進行的膜氧化過程會導致鐵元素的積累，引起細胞膜的損傷，進而縮短紅細胞壽命。實驗通過過氧化氫誘導紅細胞的系列氧化損傷模型，研究白藜蘆醇對紅細胞的保護作用。

表1 白藜蘆醇對過氧化氫引起的紅細胞氧化溶血的抑制率Table 1 Inhibitory rate of resveratrol on erythrocyte oxidation induced by H2O2%

由表1可知，在實驗研究的質(zhì)量濃度0.13～0.50mg/mL范圍內(nèi)，白藜蘆醇對過氧化氫引起的小鼠血紅細胞氧化損傷產(chǎn)生的溶血現(xiàn)象具有抑制作用，在質(zhì)量濃度0.13mg/mL時，其抑制作用較VC更強。

2.5 白藜蘆醇對小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化作用的影響

由表2可知，在質(zhì)量濃度0.10～1.00mg/mL范圍內(nèi)，白藜蘆醇對肝組織脂質(zhì)過氧化反應具有抑制作用，在質(zhì)量濃度為0.10mg/mL和0.50mg/mL時，其抑制作用較VC更強。

3 結(jié) 論

白藜蘆醇作為一種天然活性物質(zhì)，在體外具有很強的還原力，并且可以有效的清除DPPH自由基、ABTS＋·；同時在細胞和組織水平，對于自由基參與的紅細胞溶血和肝組織過氧化的相關(guān)反應，有顯著抑制和延緩作用。可見，白藜蘆醇在體外具有很強的抗氧化活性，對其進行深入的動物模型研究和作用機制探討，將對目前備受關(guān)注的抗衰老研究，具有深刻意義。后期，本課題組將對白藜蘆醇進行進一步的動物模型研究和作用機制的分子水平探討，以期為深入開發(fā)和應用這一資源提供更豐富的科學實驗依據(jù)。

[1]張學景, 鄒永, 鐘榮清, 等. 白藜蘆醇的雌激素樣作用及其治療的相關(guān)意義[J]. 中國新藥雜志, 2004, 13(8): 692-695.

[2]王超, 胡志強, 初明, 等. 白藜蘆醇對GH3細胞增殖和PRL合成的影響[J]. 中國微侵襲神經(jīng)外科雜志, 2006, 11(4): 160-163.

[3]勞鳳學, 馮驥良, 柳忠輝, 等. 白藜蘆醇誘導急性T淋巴細胞白血病Jurkat細胞凋亡[J]. 吉林大學學報, 2006, 32(2): 289-292.

[4]朱青, 張正剛, 王立峰, 等. 白藜蘆醇誘導腫瘤細胞凋亡和細胞周期阻滯的作用及機制[J]. 第四軍醫(yī)大學學報, 2005, 26(21): 1935-1937.

[5]JANG M, CAI L, UDEANI G O, et al. Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a anatural product derived from grapes[J]. Science, 1997, 275(10): 218-220.

[6]付招娣, 曹玉, 王凱風, 等. 白藜蘆醇對癌的化學預防作用[J]. 癌癥, 2004, 23(8): 869-873.

[7]呂秋軍, 溫利青, 張敏, 等. 白藜蘆醇的輻射預防及其分子機制的研究[J]. 中華放射醫(yī)學與防護雜志, 2004, 24(1): 21-22.

[8]DOBRYDNEVA Y, WILLIAMS R L, MORRIS G Z, et al. Dietary phytoestrogens and their synthetic structural analoguca as calcrum channel blockers in human plateicta[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2002, 40: 399-410.

[9]HAJRA L, EVANS A I, CHEN V I, et al. The NF-kappa B signal transduction pathway in aortic endothelial cells in primed foractivation in regiona predisposed to athemaclerotic jesion formation[J]. Proc Natl Acid Sci USA, 2000, 97: 9052-9076.

[10]HOLMES-MCNARY M, BALDWIN A S, Jr. Chemopreventive properties of transresverstorl are associated with inhibition of activation of the IkB kinase[J]. Cancer Res, 2000, 60: 3477-3483.

[11]呂秋軍, 謝潔瓊, 溫利青. 白藜蘆醇對大鼠慢性肝纖維化的影響[J].中藥新藥雜志, 2005, 4(7): 855-858.

[12]莫志賢, 邵紅霞, 鄭有順. 白藜蘆醇苷對肝細胞氧損傷的保護作用[J]. 中藥藥理與臨床, 1999, 15(6): 6-8.

[13]BLOIS M S. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical[J]. Nature, 1958, 181: 1199-1200.

[14]BONDET V, BRAND-WILLIAMS W, BERSET C. Kinetics and mechanisms of antioxidant activity using the DPPH free radical method [J]. Lebensmittel-Wissenschaft und -Technologie/Food Science and Technology, 1997, 30: 609-615.

[15]BRAND-WILLIAMS W, CUVELIER M E, BERSET C. Use of a free radical method to evaluate antioxidantactivity[J]. Lebensmittel-Wissenschaft und -Technologie/Food Science and Technology, 1995, 28:25-30.

[16]YAMAGUCHI T, TAKAMURA H, MATOBA T, et al. HPLC method for evaluation of free radical scavenging activity of foods by using 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl[J]. Biosci Biotech Biochem, 1998, 62: 1201-1204.

[17]MILLER N J, RICE-EVANS C. A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates[J]. Clin Sci, 1993, 84: 407-402.

[18]RICE-EVANS C, MILLER H J. Total antioxidant status in plasma and body fluids[J]. Methods Enzymol, 1994, 234: 279-283.

[19]杜彬, 朱鳳妹, 馬建軍, 等. 釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇的抗氧化活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2008, 20(5): 899-902.

[20]NAGABABU E, FABRY M E, NAGEL R L, et al. Heme degradation and oxidative stress in murine models for hemoglobinopathies: thalassemia, sickle cell disease and hemoglobin C disease[J]. Blood Cells Molecules and Diseases, 2008, 41(1): 60-66．

Antioxidant Activity of Resveratrol in vitro

ZHANG Ze-sheng1，HE Wei1，LIU Tian-tian1，SHI Shen1,2，LI Sen1
(1. Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Ministry of Education, College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China；2. Tiens Group Co. Ltd., Post-doctoral Workstation, Tianjin 301700, China)

In the present study, the antioxidant activity of resveratrol in vitro was evaluated based on DPPH radical scavenging capacity, ABTS free radical scavenging capacity and reducing power, respectively. Meanwhile, the oxidation model of red blood cells induced by hydrogen peroxide and liver lipid peroxidation model were used to explore the inhibitory effect of resveratrol on free radical-induced damages and lipid peroxidation. The results showed that resveratrol had strong scavenging activity against free radicals and inhibitory effect on oxidative damage induced free radicals in a dose-dependent manner.

resveratrol；antioxidation；DPPH free radical；ABTS free radical；reducing power；lipid peroxidation

TS201.2

A

1002-6630(2012)11-0266-03

2011-06-02

高等學校博士學科點專項科研基金項目(20101208110001)

張澤生(1956—)，男，教授，博士，主要從事營養(yǎng)與功能性食品、天然產(chǎn)物研究。E-mail：zhangzesheng@tust.edu.cn