鐘先鋒，羅 婷，鄧澤元,*，劉 蓉，范亞葦

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471000)

大黃酸對(duì)正常和氧化損傷內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和氧化保護(hù)作用

鐘先鋒1,2，羅 婷1，鄧澤元1,*，劉 蓉1，范亞葦1

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471000)

目的：觀察大黃酸對(duì)正常和氧化損傷的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的影響。方法：建立H2O2氧化損傷模型，采用不同濃度的大黃酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行處理，檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放率、丙二醛(MDA)含量、一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(NOS)活力和超氧化物歧化酶(SOD) 活力及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活力的變化；采用流式細(xì)胞術(shù)研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況，探討大黃酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果：大黃酸濃度在16μmol/L以下時(shí)，對(duì)HUVEC的增殖無(wú)顯著性影響；濃度在2μmol/L以上時(shí)，減輕HUVEC受到氧化損傷的程度，對(duì)氧化性損傷具有保護(hù)作用；同時(shí)降低了LDH釋放率，下調(diào)了MDA含量，提高了NO含量和NOS、SOD、GSH-Px的酶活力，顯著減少了細(xì)胞凋亡率。結(jié)論：HUVEC經(jīng)2～16μmol/L大黃酸處理，可以有效減輕H2O2對(duì)其造成的氧化損傷，維持正常的生理形態(tài)。

大黃酸；氧化損傷；內(nèi)皮細(xì)胞；增殖

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心血管系統(tǒng)中常見(jiàn)的病理過(guò)程[1]?，F(xiàn)已得到廣泛公認(rèn)的是AS的形成是由于各種損傷因素(氧自由基、高血壓、膽固醇低密度脂蛋白等)作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，EC)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙并進(jìn)一步表達(dá)和釋放各種活性物質(zhì)及黏附分子共同參與的慢性炎癥過(guò)程[2]。氧自由基等損傷因素存在于人類血漿及動(dòng)脈斑塊中，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有較強(qiáng)的損害作用。氧化損傷內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制包括通過(guò)細(xì)胞毒性作用損傷內(nèi)皮細(xì)胞，引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和通透性增高，細(xì)胞膜內(nèi)外物質(zhì)組成和比例發(fā)生變化，改變血管的生理作用，使血管對(duì)一些因子失去反應(yīng)；而且氧化損傷產(chǎn)生過(guò)量脂質(zhì)過(guò)氧化物能使血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死，增強(qiáng)脂質(zhì)蛋白對(duì)動(dòng)脈壁的通透性；另外，通過(guò)各種途徑導(dǎo)致體內(nèi)NO大量失活，從而減弱NO清除超氧化物的作用，進(jìn)一步引起氧化，從而加重了氧化應(yīng)激對(duì)血管內(nèi)皮的損傷。內(nèi)皮細(xì)胞損傷是AS的形成和發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)[3]，為了預(yù)防和治療AS，減少內(nèi)皮細(xì)胞接觸損傷因素的機(jī)會(huì)是至關(guān)重要的，故進(jìn)行早期逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷導(dǎo)致的功能障礙對(duì)AS的發(fā)病具有積極的預(yù)防作用。

大黃酸(rhein)是我國(guó)蘆薈、大黃等傳統(tǒng)中藥的主要功效成分，屬單蒽核類1,8-二羥基蒽醌衍生物，含有2個(gè)羥基和1個(gè)羧基，極性強(qiáng)，具有電化學(xué)氧化還原性質(zhì)[4]。大黃酸及其衍生物(如大黃酸鬼臼毒素、賴氨大黃酸、大黃酸-N-β-羥乙基替加氟酯)具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、瀉下、腎保護(hù)、影響心血管系統(tǒng)以及調(diào)脂等生理功能[5-7]。

本研究以培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)為材料，觀察大黃酸對(duì)HUVEC增殖的影響，探討大黃酸對(duì)損傷后HUVEC的保護(hù)作用。旨在篩選干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的功效成分，從多路徑探討其作用的分子生物學(xué)機(jī)制，為預(yù)防和治療血管內(nèi)皮功能障礙提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供；大黃酸購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110757-200206。

DMEM干粉培養(yǎng)基、胎牛血清 美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT) 美國(guó)Sigma公司；LDH、MDA、NOS、NO、SOD、GSH-Px試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

XSP-300顯微鏡 上海蔡康光學(xué)儀器公司；MK3酶標(biāo)儀 芬蘭Thermo Multiskan公司；SW-CJ系列潔凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備工程有限公司；CO2培養(yǎng)箱 日本三洋電氣公司；N15型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 香港Heal Force公司；流式細(xì)胞儀 美國(guó)Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株復(fù)蘇，接種于50mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，待生長(zhǎng)鋪滿后，經(jīng)2.5g/L胰蛋白酶消化傳代，放置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，正常培養(yǎng)3～4代后分組實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 大黃酸對(duì)HUVEC增殖的影響(MTT法)

將80%融合生長(zhǎng)的HUVEC以胰蛋白酶消化液消化，收集細(xì)胞，接種于96孔板。正常培養(yǎng)24h后，用磷酸緩沖液(PBS)洗去未貼壁細(xì)胞。換用無(wú)血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8h，使細(xì)胞同步化。然后換用含5%胎牛血清和不同濃度大黃酸的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，其中1～6組大黃酸的濃度分別為64、32、16、8、4、2μmol/L，每組6個(gè)復(fù)孔，設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜(DMSO))，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、DMSO)，每組設(shè)定4復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，移出培養(yǎng)液，換入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液100μL/孔，并于每孔加入5g/L MTT 10μL。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄原培養(yǎng)液，每孔中加入DMSO 150μL，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解，并用酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度(OD)值。定義對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%，其余各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率按公式(1)計(jì)算。

1.3.3 大黃酸對(duì)HUVEC損傷的保護(hù)作用

將細(xì)胞分為對(duì)照組、H2O2組(200μmol/L H2O2)和大黃酸組(1～16μmoL/L大黃酸+200μmol/L H2O2)。前期實(shí)驗(yàn)操作同1.3.2節(jié)，加入不同濃度的大黃酸后，培養(yǎng)24h，加入200μmol/l H2O2作用6h。然后換入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液100μL/孔，并于每孔加入5g/L MTT 10μL。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加入二甲基亞砜DMSO 150μL，用酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值，按照式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.4 測(cè)定大黃酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞LDH、MDA、NOS、NO、SOD、GSH-Px的影響

使用南京建成生物工程研究所L D H、M D A、NOS、NO、SOD、GSH-Px試劑盒測(cè)定每組HUVEC的各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

實(shí)驗(yàn)分組同1.3.3節(jié)，不同處理的HUVEC用不含EDTA的胰蛋白酶消化，PBS洗滌2遍，加入500μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，使用5μL異硫氰酸熒光素(FITC)和5μL碘化丙啶(PI)在室溫避光反應(yīng)10min，在1h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測(cè)。

表1 大黃酸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞LDH、MDA、NOS、NO、SOD、GSH-Px的影響Table 1 Effect of rhein on LDH, MDA, NOS, NO, SOD and GSH-Px in HUVECs

2 結(jié)果與分析

2.1 大黃酸對(duì)HUVEC增殖的影響

圖1 不同濃度大黃酸對(duì)HUVEC增殖的影響Fig.1 Effect of rhein on the proliferation of HUVECs

由圖1可知，大黃酸濃度在16μmol/L及以下時(shí)，對(duì)HUVEC的增殖無(wú)顯著性影響，而達(dá)到32μmol/L時(shí)，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)一定的細(xì)胞毒性，故選擇大黃酸的添加濃度在16μmol/L以下，以此排除大黃酸對(duì)HUVEC的毒性損傷。

2.2 大黃酸對(duì)HUVEC氧化損傷的保護(hù)作用

圖2 不同濃度大黃酸對(duì)HUVEC氧化損傷的保護(hù)作用Fig.2 Protective effect of rhein on oxidative damage of HUVECs

由圖2可知，HUVEC經(jīng)200μmol/L H2O2氧化損傷后，細(xì)胞存活率為76.3%，而在大黃酸濃度在2、4、8、16μmol/L時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞的存活率分別為79.0%、81.1%、83.3%、89.5%，均有顯著保護(hù)HUVEC免受氧化損傷作用。

2.3 大黃酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞LDH、MDA、NOS、NO、SOD、GSH-Px的影響

由表1可知，對(duì)照組和H2O2組相比較，LDH的釋放率和MDA含量分別從36.5%、26.15nmol/mg pro上升到54.9%、42.38nmol/mg pro；而NOS酶活力、NO含量、SOD酶活力以及GSH-Px酶活力含量則由3.99U/mg pro、65.67μmol/L、120.08U/mg pro、151.82U/mg pro下降為1.84U/mg pro、24.64μmol/L、45.43U/mg pro、80.16U/mg pro。

比較大黃酸不同濃度組，發(fā)現(xiàn)隨著大黃酸濃度的增大，LDH的釋放率和MDA含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，當(dāng)大黃酸濃度大于4μmol/L時(shí)，LDH的釋放率和MDA含量與H2O2組相比，有顯著性差異。

對(duì)SOD、NOS、NO、GSH-Px這些指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果顯示，HUVEC經(jīng)過(guò)H2O2處理后，SOD酶活力、NOS酶活力、NO含量、GSH-Px酶活力均產(chǎn)生顯著降低，說(shuō)明大黃酸對(duì)細(xì)胞造成了顯著的氧化性損傷，而加入大黃酸進(jìn)行預(yù)防性保護(hù)后，NOS酶活力、NO含量、SOD酶活力、GSH-Px酶活力都出現(xiàn)不同程度的回升。測(cè)定結(jié)果提示HUVEC經(jīng)大黃酸預(yù)處理，可以有效減輕H2O2的氧化損傷，保護(hù)細(xì)胞免受更大的氧化性損傷。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HUVEC凋亡

圖3 FITC-PI通道的二維散點(diǎn)圖Fig.3 Bivariate graphs for the FITC-PI fluorescent resolution of EC

由圖3可知，HUVEC經(jīng)H2O2氧化損傷后，41.7%的細(xì)胞進(jìn)入早期凋亡，2.1%的細(xì)胞進(jìn)入晚期凋亡或者壞死，而16μmol/L大黃酸處理后，有21.1%的細(xì)胞進(jìn)入早期凋亡，0.7%的細(xì)胞進(jìn)入晚期凋亡或者壞死，提示大黃酸可以保護(hù)HUVEC免受氧化損傷，降低細(xì)胞凋亡率，維持正常生理功能。

3 討 論

3.1 內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型和藥物作用范圍的選擇

人體內(nèi)代謝的各種反應(yīng)，大多會(huì)產(chǎn)生自由基，其中以O(shè)2-·產(chǎn)生最快[8]。氧自由基可作用于內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜，引起鏈?zhǔn)竭^(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生許多脂質(zhì)過(guò)氧化物。脂質(zhì)過(guò)氧化物不僅會(huì)損傷細(xì)胞DNA，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和壞死，而且可以作為非常重要的信使分子，介導(dǎo)各種各樣凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。血管內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)度凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈綜合癥等心血管疾病發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[9]。抑制氧自由基誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度凋亡是心血管疾病防治的重點(diǎn)環(huán)節(jié)，而大黃酸有抗氧化和防治心腦血管病的作用[10]。建立細(xì)胞氧化損傷模型，多采用H2O2、ox-LDL、乙醇等試劑，本實(shí)驗(yàn)利用H2O2產(chǎn)生O2-·來(lái)建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，因?yàn)樵撓到y(tǒng)較為穩(wěn)定科學(xué)，簡(jiǎn)便易行，適用于篩選藥物。綜合文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)采用200μmol/L的 H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

大量人工或者天然的食物和藥物對(duì)細(xì)胞都有細(xì)胞毒性，在研究各種藥物對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用時(shí)，應(yīng)設(shè)法排除毒性對(duì)細(xì)胞的影響。大黃酸濃度在大于32μmol/L時(shí)，對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用，有顯著性差異。所以設(shè)計(jì)了添加1～16μmol/L的大黃酸作為藥物組濃度的實(shí)驗(yàn)方案。

3.2 大黃酸保護(hù)HUVEC免受氧化損傷的機(jī)制

AS的發(fā)生是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞受各種危害因素?fù)p傷[11]，使血管壁局部產(chǎn)生的過(guò)度慢性炎性反應(yīng)，是細(xì)胞受損后的一種保護(hù)性反應(yīng)，如果損傷加重，則會(huì)造成過(guò)度的炎性纖維增生性反應(yīng)，最終導(dǎo)致動(dòng)脈管腔的堵塞。有研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞的再生和增殖作用是動(dòng)脈粥樣硬化的修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[12]。

大黃酸(大于2μmol/L)可以增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞抵御H2O2氧化損傷的能力，這可能與大黃酸具有較強(qiáng)的氧化還原能力有關(guān)。對(duì)LDH、MDA、SOD、NOS、NO、GSH-Px的測(cè)定結(jié)果也證實(shí)了這點(diǎn)。

LDH釋放率受H2O2氧化損傷的影響升高，這可能是因?yàn)榧?xì)胞損傷時(shí)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)氧依賴性酶及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到影響，細(xì)胞膜通透性顯著提高，細(xì)胞內(nèi)的LDH產(chǎn)生增加，同時(shí)向細(xì)胞外的漏出也相應(yīng)增加。LDH釋放率反映了細(xì)胞膜受損傷的程度，是評(píng)估細(xì)胞損傷重要指標(biāo)之一。MDA也是評(píng)估體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)之一，間接反應(yīng)細(xì)胞損傷的在體內(nèi)的自由基可以通過(guò)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，放大活性氧的危害[13]。大黃酸促進(jìn)了NOS和NO的分泌量，而NOS和NO是維持血管正常生理功能的重要活性物質(zhì)，是具有雙重作用的體內(nèi)局部調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞的增生和分化有關(guān)，能清除體內(nèi)自由基。大黃酸也促進(jìn)了SOD和GSH-Px的分泌量，SOD能消除人體在吸收代謝過(guò)程中生成的有毒有害物質(zhì)，人體不斷地補(bǔ)充 SOD具有抗衰老的特殊效果[14]，可以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)的平衡；GSH-Px主要生理功能是清除自由基、抗氧化、抗衰老，可消除H2O2產(chǎn)生自由基而損傷細(xì)胞膜的危害，同時(shí)GSH-Px還可以提高人體免疫力，增進(jìn)血球制造保護(hù)物質(zhì)的功能，保護(hù)身體免受感染，降低細(xì)胞制造發(fā)炎物質(zhì)的總量。

血管的增生除了與血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有關(guān)外，還受血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響[15]。細(xì)胞凋亡導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)的DNA因漏出而減少，故在流式細(xì)胞儀圖形上，出現(xiàn)凋亡細(xì)胞峰。H2O2組細(xì)胞因氧化損傷大量凋亡，加入大黃酸預(yù)處理后，大大減少了凋亡率，保持了內(nèi)皮細(xì)胞的正?；盍蜕砉δ?。

綜上，大黃酸在2～16μmol/L濃度條件下，無(wú)顯著細(xì)胞毒性；內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后，細(xì)胞膜氧依賴性酶及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到影響，細(xì)胞膜通透性顯著提高，LDH釋放率、MDA含量顯著升高，NOS、NO等活性物質(zhì)和重要因子分泌量減少，SOD、GSH得不到補(bǔ)充，自由基清除能力下降，細(xì)胞凋亡率上升。大黃酸預(yù)處理后，因?yàn)榇簏S酸本身的氧化還原能力，同時(shí)改善了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖情況，減少了LDH釋放率，抵御了細(xì)胞的過(guò)度脂質(zhì)過(guò)氧化，NOS、NO、SOD、GSH等活性物質(zhì)的分泌量回升，防止細(xì)胞發(fā)生凋亡，維持了細(xì)胞正常的生理形態(tài)，保護(hù)了內(nèi)皮細(xì)胞，阻止AS的發(fā)生和發(fā)展。

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Proliferative and Protective Effects of Rhein on Normal and Oxidatively Injured Endothelial Cells

ZHONG Xian-feng1,2，LUO Ting1，DENG Ze-yuan1,*，LIU Rong1，F(xiàn)AN Ya-wei1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471000, China)

Objective: To study the effect of rhein on the proliferation and oxidative damage of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Methods: An oxidative injury model was established with H2O2. HUVECs were incubated with rhein at various concentrations and the availability of rhein for protecting endothelial cells was explored. The release rate of lactic acid dehydrogenase (LDH), the contents of malondialdehyde (MDA) and NO, and the activities of nitrogen oxide synthase (NOS), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) were determined. Flow cytometry was employed to investigate the apoptosis of HUVECs. Results: Rhein had no obvious effect on the proliferation of HUVECs when the concentration of rhein was less than 16 μmol/L. However, rhein at a concentration of more than 2 μmol/L could reveal significant protection against oxidative damage in HUVECs. The release rate of LDH and the content of MDA revealed an obvious decrease, whereas the content of NO and the activities of NOS, SOD and GSH-Px exhibited an obvious increase. The rates of apoptosis and necrosis were reduced significantly. Conclusion: Rhein can maintain the normal physiology of the cells and prevent the cells from H2O2-induced injury at a concentration of 2—16 μmol/L. It is particularly important for the prevention and treatment of atherosclerosis.

rhein；oxidative damage；endothelial cells；proliferation

R151

A

1002-6630(2012)11-0257-05

2011-06-29

江西省研究生創(chuàng)新專項(xiàng)資金項(xiàng)目(YC10A016)；食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自由探索課題(SKLF-TS-200921)

鐘先鋒(1981—)，男，講師，博士研究生，研究方向?yàn)榭箘?dòng)脈粥樣硬化藥物篩選。E-mail：zhongxf81@126.com

*通信作者：鄧澤元(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)橹九c健康。E-mail：dengzeyuan28@yahoo.com.cn