蔣國玲，陳 潔，張萌萌，孫志高*

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.中國農業(yè)科學院柑桔研究所，重慶 400712；3.浙江海洋學院食品與藥學學院，浙江 舟山 316004)

制備鮐魚魚肉發(fā)酵液中抗氧化因子的條件優(yōu)化

蔣國玲1,2,3，陳 潔3，張萌萌1,2，孫志高2,*

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.中國農業(yè)科學院柑桔研究所，重慶 400712；3.浙江海洋學院食品與藥學學院，浙江 舟山 316004)

以食品級枯草芽孢桿菌為實驗用菌，通過發(fā)酵法制備具有抗氧化作用的鮐魚魚肉發(fā)酵液。在液體培養(yǎng)基的基礎上研究裝液量、葡萄糖添加量、魚肉培養(yǎng)基料液比、培養(yǎng)轉速對發(fā)酵產物的影響，結果表明：裝液量50mL/250mL或100mL/250mL、葡萄糖添加量2%、魚肉:水料液比(m/V)1:(1～2)、搖床轉速150r/min條件下，發(fā)酵液的抗氧化性較高。在加糖量、裝液量及料液比對試驗結果影響較大的單因素試驗基礎上，采用響應面分析法(Box-Behnken)對發(fā)酵魚肉培養(yǎng)基制備抗氧化型發(fā)酵液的工藝參數(shù)進行優(yōu)化后，得出最佳條件為：葡萄糖添加量3.98%、裝液量96.02mL/250mL、魚肉:水料液比1:1.60，其發(fā)酵液的DPPH自由基清除率可達 94.52%。

魚肉蛋白；抗氧化因子；枯草芽孢桿菌；發(fā)酵液；抗氧化性

物質的抗氧能力是有抗氧化因子所決定的，抗氧化因子是指可中和機體所產生的氧“自由基”、保護機體細胞免受傷害的一類物質?？寡趸蜃拥膩碓粗饕腔瘜W法合成和從天然生物中提取。但隨著科技的進步和人類生活水平的提高，以及對自身健康意識的增強，越來越多的人認識到化學合成抗氧化因子存在對人體潛在的危害性[1-3]。從天然生物中提取抗氧化因子，因其天然、高效、低毒的特點日益受到國內外專家的普遍認可，有逐步取代人工合成抗氧化劑的趨勢[4]。天然抗氧化因子的來源主要包括植物和海洋生物，盡管我國有豐富的植物和海洋生物資源；但在研究和生產過程中發(fā)現(xiàn)從生物中提取抗氧化因子的工藝技術復雜、提取率低、成本較高，這已成為制約天然抗氧化因子快速發(fā)展的瓶頸因素。目前國外學者在用微生物發(fā)酵的方法制備天然抗氧化因子方面進行了一些研究，取得了一定的成果[5-7]。研究證實，利用微生物發(fā)酵的方法可以提高抗氧化因子的產率，降低成本，節(jié)約資源，具有廣泛的應用前景。

本實驗以食品級枯草芽孢桿菌為實驗菌株，通過發(fā)酵低值魚蛋白方式制備具有抗氧化活性的發(fā)酵液，為大批量、低成本制備天然抗氧化因子提供技術參考，為低值魚的深加工利用提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：食品級枯草芽孢桿菌由浙江海洋學院食品與藥學學院實驗室提供，實驗所用鮐魚魚肉購自 舟山市菜場。

氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸、無水乙醇、葡萄糖國藥集團化學試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司；蛋白胨、純化瓊脂粉(細菌級) 杭州天和微生物試劑有限公司；酵母浸膏 中國醫(yī)藥集團上海化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平、電子分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；低速離心機 上海安亭科學儀器廠；水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；旋轉蒸發(fā)儀上海愛朗儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森實驗儀器有限公司；電子調溫電熱套 天津泰斯特儀器有限公司；精密pH計、可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；立式電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波東北儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

LB培養(yǎng)基：酵母浸粉 5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 10.0g、蒸餾水1000mL，pH7.0。LB葡萄糖培養(yǎng)基：酵母浸粉 5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 10.0g、葡萄糖10g、蒸餾水1000mL，pH7.0。魚肉發(fā)酵培養(yǎng)基：按照魚肉:水，料液比為1:2(m/V)的比例打成勻漿、自然pH值、高壓滅菌30min[8]。

1.3.2 菌種的活化與保存

配制LB液體培養(yǎng)基100mL，調pH值至7.0，經121℃滅菌20min且冷卻后，在超凈臺上接種，每100mL LB液體培養(yǎng)基內接入原始菌種100μL，在37℃恒溫搖床培養(yǎng)箱中，在150r/min條件下培養(yǎng)10～12h[9]。

采用甘油保存方式：在已滅菌的1.5mL EP管中分別加入500μL 的活化菌液和60%甘油500μL，充分混合后即為30%的甘油保存菌種[10]。

1.3.3 生長曲線的測定

1.3.3.1 種子液的制備

用接種環(huán)挑取LB固體培養(yǎng)基上的單菌落，接種于已滅菌的LB培養(yǎng)基(50mL/150mL三角瓶)中，在37℃、150r/min振蕩培養(yǎng)24h后，使菌液含量達到107CFU/mL作種子液備用[11]。

1.3.3.2 生長曲線的繪制

準確吸取1mL種子液，加入已編號的LB(50mL/250mL)錐形瓶中，在37℃、150r/min振蕩培養(yǎng)。每隔4 h取出一些培養(yǎng)液注入已滅菌的試管中，暫放4℃冰箱中保存，待培養(yǎng)結束后，以未接種的LB液體培養(yǎng)基做空白，統(tǒng)一測定不同培養(yǎng)時間段的OD570nm值。對濃度大的菌懸液用空白LB液體培養(yǎng)基適當稀釋使其OD570nm值在0.10～1.00之間，稀釋后所得的OD570nm值乘以相應稀釋倍數(shù)，以得到培養(yǎng)液實際的OD570nm值。然后以時間為橫坐標，以OD570nm值為縱坐標，繪制枯草芽孢桿菌的生長曲線[9]。

1.3.4 抗氧化性的檢測[12-14]

通過測定發(fā)酵液對DPPH自由基的清除能力，來判定發(fā)酵液的抗氧化性能，方法如下：樣品在8000r/min離心10min，取上清液備用。 然后再準確稱取0.0200g DPPH溶解在無水乙醇中，用100mL棕色容量瓶定容，放入冰箱中備用。

樣品混合物組：1mL樣品＋1mL 99.5%乙醇溶液＋250μL質量濃度為0.02g/100mL DPPH乙醇溶液；對照組：1 mL蒸餾水＋1 mL 99.5%乙醇溶液＋250μL質量濃度為0.02 g/100mL DPPH乙醇溶液；空白組：1mL樣品＋1mL 99.5%乙醇溶液＋250μL乙醇溶液。

將混合物放在室溫暗室中存放60min后，以99.5%的乙醇調零，測定517nm波長處測吸光度。

式中：A1為對照組吸光度；A2為空白組吸光度；Ax為樣品混合物組的吸光度。

1.3.5 培養(yǎng)時間對抗氧化性的影響

基于枯草芽孢桿菌在20～72h均處于穩(wěn)定生長期，用DPPH法在20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、62、68、72h培養(yǎng)時間段，分別測定其抗氧化性。

1.3.6 接種量對抗氧化性的影響

基于枯草芽孢桿菌抗氧化性最佳的發(fā)酵菌液，分別按2%、3%、5%、8%、10%的接種量將活化24h的食用枯草芽孢桿菌菌液轉接入50mL的LB葡萄糖培養(yǎng)基中，其他條件相同。在37℃、150r/min發(fā)酵培養(yǎng)24h后，用DPPH法檢測代謝產物的抗氧化性，以確定出最佳的接種量。

1.3.7 制備魚肉發(fā)酵中抗氧化因子工藝參數(shù)的研究[15-17]

1.3.7.1 魚肉培養(yǎng)基料液比的確定

按照魚肉:水為1:1、1:2、1:3、1:4(m/V)的比例打成勻漿制備發(fā)酵培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中添加1.0%的葡萄糖，經121℃高壓滅菌30min后，按最適宜接菌量將活化24h的食用枯草芽孢桿菌菌液接入其中，在37℃、150r/min發(fā)酵培養(yǎng)24h后，用DPPH法測定抗氧化性，以確定出最佳的料液比。

1.3.7.2 葡萄糖添加量的確定

以魚肉:水為1:1(m/V)配制培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中葡萄糖加入量分別為1.0%、1.5%、2.0%、3.0%，經121℃高壓滅菌30min后，按最適宜接菌量將活化24h的食用枯草芽孢桿菌菌液接入其中，在37℃、150r/min發(fā)酵培養(yǎng)24h后，用DPPH法測定抗氧化性，以確定葡萄糖添加量對代謝產物抗氧化性的影響。

1.3.7.3 魚肉培養(yǎng)基裝液量的確定

以魚肉:水為1:1(m/V)和葡萄糖添加量2.0%配制培養(yǎng)基，在250mL的三角瓶中分別裝入25、50、75、100mL魚肉培養(yǎng)基，其他條件相同，在121℃高壓滅菌30min后，按最適宜接菌量將活化24h的食用枯草芽孢桿菌菌液接入，在37℃、150r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)24h后用DPPH法檢測代謝產物的抗氧化性，以確定最適的培養(yǎng)裝液量。

1.3.7.4 搖床轉速的確定

以魚肉:水為1:1(m/V)、葡萄糖添加量2.0%配制培養(yǎng)基，按最適接種量將活化24h的食用枯草芽孢桿菌菌液接種，在分別以120、150、180r/min的轉速、37℃培養(yǎng)24h后，用DPPH法檢測代謝產物的抗氧化性，以確定搖床最佳轉速。

1.3.8 提高魚肉發(fā)酵液抗氧化性的工藝參數(shù)優(yōu)化

在單因素試驗基礎上，以培養(yǎng)基裝液量、葡萄糖添加量、魚肉培養(yǎng)基料液比對應的獨立變量X1、X2、X3，以發(fā)酵液對DPPH自由基清除提高率Y為響應值。根據(jù)Box-Behnken的中心原理組合設計試驗方案，利用SAS(9.0)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，以獲得最適工藝參數(shù)，實驗水平因素[18-20]見表1。

表1 響應面分析試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌的生長曲線

圖1 枯草芽孢桿菌的生長曲線圖Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis

由圖1可知，枯草芽孢桿菌在0～4h時處于調整生長期，在4～20h處于對數(shù)增長期，20～72h處于穩(wěn)定生長期。故在進行接種時可選用活化培養(yǎng)20～24h的菌液進行接種，此時菌體處于對數(shù)生長后剛進入穩(wěn)定初期，菌種的數(shù)量和質量可以滿足發(fā)酵接種的要求。

2.2 培養(yǎng)時間對抗氧化性的影響

圖2 培養(yǎng)時間對抗氧化性的影響Fig.2 Effect of incubation time on the antioxidant activity of fermented fish broth

由圖2可知，培養(yǎng)24h時菌液的抗氧化性最高，而隨著培養(yǎng)時間的延長對DPPH自由基的清除率呈下降趨勢，隨著發(fā)酵的進行，次級代謝產物越來越多，會影響抗氧化性，故DPPH法進行抗氧化性測定的時間選定為發(fā)酵24h的菌液。

2.3 接種量對抗氧化性的影響

圖3 接種量對抗氧化性的影響Fig.3 Effect of inoculum size on the antioxidant activity of fermented fish broth

由圖3可知，隨著接種量的增加，對DPPH自由基清除率呈下降趨勢。一般認為，接種量大有利于縮短延遲期，但如果接種量過大，隨著種子培養(yǎng)基引入的抑制性次生代謝產物等有害物質也相應增多，不利于抗氧化物的合成。實驗結果證實，當接種量為2%時，對DPPH自由基清除率最高，清除率達90.14%，故選擇2%為最佳接種量。

2.4 對制備魚肉發(fā)酵液的最佳工藝參數(shù)的單因素試驗

2.4.1 料液比對抗氧化性的影響

以魚肉培養(yǎng)基(50mL/250mL)進行發(fā)酵培養(yǎng)，研究料液比(魚肉:水)對抗氧化性的影響，結果如圖4所示。隨著培養(yǎng)基中加水量的增加，發(fā)酵液的抗氧化能力逐漸降低。原因可能是隨著發(fā)酵的進行，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質不斷減少，菌體產生的次級代謝產物增多，可能會干擾對抗氧化性物質的檢測。由結果可知，當魚肉:水料液化為1:(1～2)時，發(fā)酵液的抗氧化能力較高。

2.4.2 葡萄糖添加量對抗氧化性的影響

圖5 葡萄糖添加量對抗氧化性的影響Fig.5 Effect of glucose on the antioxidant activity of fermented fish broth

以魚肉培養(yǎng)基(50mL/250mL)進行發(fā)酵培養(yǎng)，研究葡萄糖添加量對抗氧化性的影響，結果如圖5所示。隨著葡萄糖添加量的增加發(fā)酵產物的抗氧化性增強，當葡萄糖添加量2.0%時DPPH自由基清除率最高。因含糖量增高，會導致微生物生長的環(huán)境滲透壓增高，從而抑制微生物的生長，會直接導致發(fā)酵液的抗氧化性能降低，故選2.0%為最適葡萄糖添加量。

2.4.3 裝液量對抗氧化性的影響

圖6 魚肉培養(yǎng)基裝液量對抗氧化性的影響Fig.6 Effect of medium volume on the antioxidant activity of fermented fish broth

由圖6可知，裝液量在50mL/250mL和100mL/250mL時發(fā)酵產物的抗氧化性較高。當營養(yǎng)物質充分，而通氣量又能提供有氧呼吸時，菌體的長勢最好，發(fā)酵液抗氧化也增強。

2.4.4 搖床轉速對抗氧化性的影響

以魚肉培養(yǎng)基(50mL/250mL)進行發(fā)酵培養(yǎng)，研究了轉速對抗氧化性的影響，結果如圖7所示。隨著搖床轉速的增加，通氣量加大，溶氧量增加，菌體活力增強，發(fā)酵液的抗氧化能力也隨之增強，但當振蕩過于激烈時，可能是造成了菌絲破裂，細胞內容物外滲，使菌體發(fā)酵產物的抗氧化性下降，故當搖床轉速為150r/min時菌體發(fā)酵液抗氧化性最強。

圖7 魚肉培養(yǎng)基搖床轉速對抗氧化性的影響Fig.7 Effect of rotation speed on the antioxidant activity of fermented fish broth

2.5 魚肉發(fā)酵液最佳工藝參數(shù)的優(yōu)化

利用RSA統(tǒng)計軟件通過響應回歸程序對表3試驗數(shù)據(jù)進行分析，得到的發(fā)酵液DPPH自由基清除率對3個因素的二次多項回歸模型為：

Y＝41.294-8.624X1＋0.093X2＋1.658X3＋0.016X1X2-0.500X1X2＋1.900×10-3X2X3＋3.193X12-7.428×10-4X22-0.429X32，模擬的可靠性通過方差分析和相關參數(shù)來考察，見表3。

表3 響應面分析方案及結果Table 3 Box-Behnken design and results

表4 方差分析結果Table 4 Results of variance analysis

由表4可知，模型具有顯著性(P＜0.05)，失擬項(P＞0.05)不顯著，從回歸方程各項方差的進一步檢驗可知，X22、X32顯著，X1、X3、X12極顯著，表明各項試驗因素對應的響應值不是簡單的線性關系；R2＝0.9391，表明回歸方程可以較好的描述各因素與響應值的真實關系[21]，可以利用該回歸方程確定最佳的工藝參數(shù)：裝液量96.02mL/250mL、葡萄糖添加量3.98%、魚肉:水料液比1:1.60時，在此工藝條件下，發(fā)酵液的DPPH自由基清除率可達到94.52%。

3 結 論

本實驗對生物發(fā)酵方法制備抗氧化因子條件進行了研究，結果表明：種子液的培養(yǎng)時間為22～24h，培養(yǎng)24h時，清除DPPH自由基的能力最強，在對接種量、裝液量、發(fā)酵培養(yǎng)搖床轉速、葡萄糖添加量、料液比等單因素的研究表明當接種量2%、裝液量50mL/250mL或100mL/250mL、搖床轉速150r/min、葡萄糖添加量2%、魚肉:水料液比為1:(1～2)時，發(fā)酵液的抗氧化性較強。各因素改變對發(fā)酵液抗氧化性均有影響，但影響程度不同，通過對發(fā)酵液抗氧化性影響較大的葡萄糖添加量、裝液量及料液比做響應面分析得到的最佳發(fā)酵魚肉制備抗氧化因子工藝參數(shù)為：葡萄糖添加量3.98%、裝液量96.02mL/250mL、魚肉:水料液比為1:1.60，發(fā)酵液DPPH自由基清除率達到94.52%。

[1]呂麗爽. 天然抗氧化劑低聚原花青素的研究進展[J]. 食品科學, 2002, 23(2): 147-149.

[2]喬風云, 陳欣. 抗氧化因子與天然抗氧化劑研究綜述[J]. 科學通報, 2006, 22(3): 331-335.

[3]楊洋, 韋小英. 國內外天然食品抗氧化劑的研究進展[J]. 食品科學, 2002, 23(10): 137-139.

[4]左玉, 謝文磊. 生物抗氧化劑抗氧化作用的研究進展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2006, 32(1): 62-64.

[5]房耀維, 余勃, 王淑軍, 等. 發(fā)酵法制備沙光魚多肽及其抗氧化活性[J]. 食品科學, 2010, 31(17): 298-301.

[6]劉姝, 余勃. 發(fā)酵法制備魚鰾多肽及其抗氧化活性研究[J]. 食品科學, 2009, 30(21): 332-334.

[7]MELDRUM J B, EVANS R D, ROBERTSON J L, et al. Alterations in levels of various host antioxidant factors in turkey knockdown syndrome [J]. Avtan Diseases, 2000, 44: 891-895.

[8]郝記明, 張靜, 諶素華, 等. 酶法水解珍珠貝肉蛋白質的工藝探討[J].食品科學, 2002, 23(4): 51-53.

[9]趙斌, 何紹江. 微生物學實驗[M]. 北京: 科學出版社, 2007: 64-108.

[10]何國慶, 賈英民. 食品微生物學[M]. 北京: 中國農業(yè)大學出版社, 2005: 199-207.

[11]郭宇星. 微生物發(fā)酵法制備水解乳清蛋白粉制備生物活性的研究[D].天津: 天津商學院, 2003.

[12]SZABO M R, IDITION C, CHMBRE D, et al. Improved DPPH determination for antioxidant activity spectrophotometric assay[J]. Chemical and Materials Science, 2007, 61(3): 214-216.

[13]DU Guorong, LI Mingjun, MA Fengwang, et al. Antioxidant capacity and the relationship with polyphenol and vitamin C in Actinidia fruits [J]. Food Chemistry, 2009, 11(3): 557-562.

[14]王和才, 胡秋輝. DPPH 法測定紫紅薯提取物清除自由基的能力[J].食品研究與開發(fā), 2001, 31(1): 132-135.

[15]王永宏. 京尼平的微生物制備及其作為交聯(lián)劑的應用研究[D]. 成都:四川大學, 2007.

[16]耩樂鴛, 麓舞, 羚靜, 等. 納豆枯草桿菌的篩選和納豆激酶發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 浙江大學學報, 2004, 38(10): 208-215.

[17]GURARD F, GUIMAS L, BINET A. Production of tuna waste hydrolysates by a commercial neutral protease preparation[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2002, 20(2): 489-498.

[18]PATEL N V, PATEL J K, SHAH S H. Box-behnken experimental design in the development of pecth-compritol ATO 888 compression coated colon targeted drug deltivery of mesalamine[J]. Acta Phamaceutica, 2010, 60(1): 39-54.

[19]李亞萍, 程衛(wèi)東, 詹萍, 等. 響應曲面法微波輔助提取β-胡蘿卜素工藝[J]. 食品生物技術學報, 2009, 28(4): 487-491.

[20]王欽德, 楊堅. 食品設計與統(tǒng)計分析[M]. 北京: 中國農業(yè)大學出版社, 2002: 384-416.

[21]徐子竟, 黎貴卿, 黃麗, 等. 響應面發(fā)優(yōu)化微波輔助提取滇桂艾納香多糖工藝的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(1): 220-223.

Optimization of Fermentation Conditions for Preparation of Highly Antixodant Fermmented Mackerel Broth

JIANG Guo-ling1,2,3，CHEN Jie3，ZHANG Meng-meng1,2，SUN Zhi-gao2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；
2. Cirtus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712, China；3. College of Food and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316004, China)

The preparation of fermented fish broth with high antioxidant activity from macheral meat with food-grade Bacillus subtilis was investigated in the present study. The results of one-factor-at-a-time experiments showed that highly antioxidant fermented fish broth was obtained under the fermentation conditions: medium volume of 50 mL or 100 mL in 250 mL shake flasks, glucose concentration of 2%, fish meat-to-water ratio of 1:(1-2 )(m/V), and rotation speed of 150 r/min. It was also found that glucose concentraiton, medium volume in 250 mL shake flasks and fish meat-to-water ratio were main parameters that influence the production of antioxidant ingredients. Using response surface methdology based on a Box-Behnken experimental design, the main fermentation parameters were optimized to be 3.98%, 96.02 mL/250 mL and 1:1.60(m/V), respectively. The fermented fish broth obtained under these conditions exhibited a DPPH radical scavenging rate of 94.52%.

fish protein；antioxidant factors；Bacillus subtilis；fermented broth；antioxidant activity

TS205.5

A

1002-6630(2012)11-0219-05

2011-04-18

蔣國玲(1986—)，女， 碩士研究生，研究方向為農產品加工與貯藏工程。E-mail：jgl1986123@126.com

*通信作者：孫志高(1964—)，男，副研究員，學士，研究方向為農產品加工與貯藏。E-mail：cpro@163.com