呂明生，楊 帆,，胡建恩，房耀維，焦豫良，王淑軍,*，劉 姝

(1.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.大連海洋大學(xué)食品工程學(xué)院，遼寧 大連 116023)

Thermococcus siculi HJ21 α-淀粉酶Asp186定點(diǎn)突變對酶活性的影響

呂明生1，楊 帆1,2，胡建恩2，房耀維1，焦豫良1，王淑軍1,*，劉 姝1

(1.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.大連海洋大學(xué)食品工程學(xué)院，遼寧 大連 116023)

為確定超嗜熱古菌Thermococcus siculi HJ21α-淀粉酶(TSA)中特定氨基酸及所在位點(diǎn)與酶活性間的關(guān)系，以含TSA基因的pEt-28a-His6質(zhì)粒為模板，利用定點(diǎn)突變技術(shù)，將第186位點(diǎn)的天冬氨酸(Asp)突變?yōu)樘於０?Asn)，突變子轉(zhuǎn)化至E. coli BL21(DE3)并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，測定突變前后的酶活性，定點(diǎn)突變后的TSA無酶活性；采用DNAStar和Deepview蛋白分析軟件，預(yù)測突變前后TSA蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明Thermococcus siculi HJ21α-淀粉酶的186位點(diǎn)對維持TSA的酶活性具有重要意義，它的突變導(dǎo)致酶蛋白二級結(jié)構(gòu)組件及氫鍵網(wǎng)絡(luò)的改變。

α-淀粉酶；定點(diǎn)突變；TSA基因；186位點(diǎn)；酶活性

α-淀粉酶(EC3.2.1.1)是應(yīng)用最廣泛的酶制劑之一，在動(dòng)物、植物、微生物中均能產(chǎn)生，但微生物發(fā)酵是α-淀粉酶大量生產(chǎn)的主要方式[1-2]。許多微生物中均能產(chǎn)生α-淀粉酶，主要有：Bacillus sp.、Bacteroides sp.、Clostridium sp.、Thermophile sp.、Thermomonospora sp.、Acinetobacter sp.、Pseudomonas sp.、Streptomyces sp.、Thmoactinomyces sp.、Aspergillus sp.、Mucor sp.、 Neurospora sp.、Penicillus sp.等，其中，來自于超嗜熱微生物的α-淀粉酶因具有反應(yīng)溫度高、液化速度快、對Ca2+依賴性小、pH值穩(wěn)定性高等特點(diǎn)而被作為一種理想的模型體系來探索極端環(huán)境條件下的酶催化和穩(wěn)定機(jī)制。深海古菌Thermococcus siculi HJ21菌株分泌的α-淀粉酶最適作用溫度95℃，在100℃有60%的酶活力，且保溫2h和3h后分別有40%和30%的殘余酶活，酶的最適作用pH 5.0，在pH4.5有80%的酶活力，同時(shí)，熱穩(wěn)定性不依賴Ca2+，實(shí)用性好于其他已報(bào)道的超嗜熱α-淀粉酶[3-9]。目前已對該酶進(jìn)行了基因克隆、原核表達(dá)和定向進(jìn)化，構(gòu)建了基因工程菌，優(yōu)化了菌株的發(fā)酵條件，純化了重組酶和突變酶并研究了酶學(xué)性質(zhì)，然而，酶分子結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系仍有待探索[10-12]。

本實(shí)驗(yàn)通過Blast搜索獲得P. woesei分泌的蛋白相似水平達(dá)87.3%α-淀粉酶基因序列，并在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中(protein data bank，PDB)得到它的晶體結(jié)構(gòu)(PDB：1MWO)，經(jīng)比對分析，推測處于超嗜熱古菌T.siculi HJ21α-淀粉酶Domain A的無規(guī)則卷曲上的第186位點(diǎn)氨基酸(Asp)可能對維持酶的活性起到一定的作用[13]，結(jié)合Takase等[14]對B. subtilisα-淀粉酶的氨基酸殘基上的-NH2末端的相關(guān)分析，設(shè)計(jì)了Asp186(天冬氨酸)→Asn(天冬酰胺)的定點(diǎn)突變，密碼子由GAC變?yōu)锳AC，測定了突變前后的酶活性，分析了酶的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上，初步探討超嗜熱古菌T. siculi HJ21 α-淀粉酶的活性機(jī)制，為高溫耐酸α-淀粉酶的分子設(shè)計(jì)和改造提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 菌種與宿主菌

深海古菌T.siculi HJ21 α-淀粉酶基因由本課題組克隆，保存在pEt-28a質(zhì)粒上，保藏于E.coli DH5α中?？寺∷拗鱁.coli DH5α，表達(dá)宿主E.coli BL21(DE3)。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

酵母提取物、胰蛋白胨 英國Oxiod公司；pfu DNA聚合酶、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D- 乳糖苷(X-gal)、異丙基-β-D-乳糖苷(IPTG) Promega公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I、卡那霉素(Kan)和質(zhì)粒提取試劑盒上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5、胰蛋白胨10、NaCl 10，用NaOH調(diào)pH值至7.0。LB/Kan培養(yǎng)基：含有50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基。LB/Kan/IPTG/X-Gal培養(yǎng)基：含有10μL 20% IPTG、40μL 2% X-Gal的LB/ Kan培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器與設(shè)備

170-6701PCR儀 美國伯樂公司；全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀 美國Bio Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)

利用軟件Primer 5.0，根據(jù)已克隆的超嗜熱α-淀粉酶基因序列設(shè)計(jì)引物。

突變子：Asp186- Asn GAC-AAC；引物P1：5＇-GCGCGAATTCATGAACAGGGGTATAT- 3＇ ；引物P2：5＇- CTTTGGCGGCTATCCGAACATATGCCACGACAA-3＇；引物P3：5＇-TTGTCGTGGCATATGTTCGGATAGC CGCCAAAG - 3＇；引物P4：5＇- TAGTCGACTCAGCC CACCCCACAG- 3'；引物P1與T. siculi HJ21 α-淀粉酶的成熟肽結(jié)構(gòu)基因5＇端互補(bǔ)，其自身含有起始密碼子ATG。且引物P1的5＇增加了EcoR I酶切位點(diǎn)。引物P4為下游引物，與TSA的結(jié)構(gòu)基因下游序列互補(bǔ)，并含Sal I酶切位點(diǎn)。P2和P4為不完全互補(bǔ)的兩條核苷酸單鏈。

1.2.2 質(zhì)粒的提取

將含質(zhì)粒pEt-28a-His6-TSA的E. coli DH5α按照1%接種量接種于LB/Kan培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600nm值在0.6～0.8之間，按照說明書提取質(zhì)粒。

1.2.3 定點(diǎn)突變-Over-lap法

第一輪PCR：反應(yīng)體系：10 × PCR Buffer(含MgCl2) 5μL，dNTP 1μL、質(zhì)粒pEt-28a-His6-TSA 1μL，引物P1&P3或P2&P4各1μL，加入雙蒸水40μL。輕輕混勻，最后加入pfu DNA聚合酶1μL(2.5U)，使PCR反應(yīng)體系為50μL。有引物對P1& P3或P2& P4擴(kuò)增出的片段分別為C1和C2。

反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，進(jìn)行PCR反應(yīng)(94℃30s， 60℃ 30s，72℃ 60s)， 經(jīng)過30個(gè)熱循環(huán)。熱循環(huán)后，置冰上2min。

第二輪PCR：將第一輪PCR產(chǎn)物等體積混合，取1μL混合物作為模板，以P1&P4為引物，使用pfu DNA聚合酶進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件如上。膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將PCR產(chǎn)物和非突變型的pEt-28a-His6-TSA質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I雙酶切后在T4DNA酶作用下進(jìn)行連接，取5μL連接物加入至100μL E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻，冰浴30min 后；42℃熱休克90s，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，繼續(xù)冰浴 2min；加入LB液體培養(yǎng)基400μL，37℃、120r/min 孵育45min；將培養(yǎng)物100μL 涂布到LB/Kan/IPTG/X-Gal瓊脂平板上，37℃溫箱正放培養(yǎng)30min后, 倒置培養(yǎng)14h，長出轉(zhuǎn)化子。采用藍(lán)白斑篩選法篩選陽性克隆子。擴(kuò)大培養(yǎng)白色克隆子，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定和測序。將測序含突變子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli BL21(DE3)。

1.2.5 超嗜熱古菌T. siculi HJ21α-淀粉酶的制備

將E. coli BL21、含pEt-28a-His6質(zhì)粒的E. coli BL21 (DE3)、含突變型或非突變型TSA基因的重組菌單個(gè)菌落分別接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜，取新鮮種子液4mL于100mL LB/Kan培養(yǎng)基中，37℃、180r/d，培養(yǎng)至OD600值在0.6～0.8之間。加入IPTG，使其終濃度為4mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)5h。然后8000 ×g離心5min，收集菌體。將誘導(dǎo)表達(dá)收集的菌體，用50mmol/L pH7.0磷酸緩沖液洗滌兩次。再用50mmol/L、pH7.0磷酸緩沖液重懸菌體，超聲波破碎菌體(400W，超聲3s, 停7s，共超聲15min)，4℃、12000×g離心20min，收集上清液作為粗酶液。粗酶液的純化參見文獻(xiàn)[10-11]。

1.2.6 超嗜熱古菌T. siculi HJ21α-淀粉酶的酶活力測定

取10μL酶液于10mL試管中，加入190μL 1g/100mL的可溶性淀粉乙酸鈉緩沖液(50mmol/L，pH 5.0)，在95℃水浴中反應(yīng)30min，冷卻，加入200μL DNS終止反應(yīng)，沸水中顯色10min。最后加入3mL蒸餾水稀釋，混勻，在520nm波長處測吸光度[10-11]。

酶活單位定義：在相應(yīng)條件下，1min催化產(chǎn)1μmol麥芽糖的酶量，即為1個(gè)酶活力單位，以1U表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Argarose gel electrophoresis analysis of PCR products

由圖1可知，以pEt-28a-His6-TSA為模板，直接用引物P1和P4擴(kuò)增得到了長度約為1400bp大小的片段，以引物P1和P3擴(kuò)增所得的片段C1在500bp左右，以引物P2和P4為引物擴(kuò)增所獲得片段C2為900bp左右，以C1和C2作為重疊模板進(jìn)行重疊PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物大小亦為1400bp左右，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果。

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定及DNA測序鑒定結(jié)果

1%瓊脂糖凝膠電泳篩選到的重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I雙酶切切下約 1400bp 的插入片段，初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。DNA測序重組質(zhì)粒成功地插入了TSA片段，同時(shí)重組質(zhì)粒插入的TSA片段在186位點(diǎn)的密碼子由GAC變?yōu)锳AC。

圖2 重組質(zhì)粒pEt-28a-His6-TSA雙酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Argarose gel electrophoresis analysis of plasmid pEt-28a-His6-TSA digested by EcoR I and Sal I

2.3 超嗜熱古菌T.siculi HJ21所產(chǎn)α-淀粉酶的活性測定

E. coli BL21(DE3)和含pEt-28a-His6質(zhì)粒的E. coli BL21 (DE3)菌株均未檢測到α-淀粉酶的產(chǎn)生；含非突變型TSA基因的pEt-28a-His6質(zhì)粒的E. coli BL21(DE3)重組菌能有效地表達(dá)α-淀粉酶，其酶活力為89.68U；含突變型TSA基因的pEt-28a-His6質(zhì)粒的E. coli BL21(DE3)重組菌表達(dá)的α-淀粉酶未測到酶活性。

2.4 突變前后TSA二級結(jié)構(gòu)的比較

圖3 T. siculi HJ21α-淀粉酶二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.3 Prediction of secondary structure of T. siculi HJ21 α-amylase

利用DNAStar軟件，通過準(zhǔn)確率較高的Garnier-Robson法計(jì)算特定氨基酸在特定結(jié)構(gòu)內(nèi)部的可能性來預(yù)測蛋白質(zhì)分子中的卷曲螺旋(coiled coil)、螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲等二級結(jié)構(gòu)區(qū)域[15]。如圖3所示，突變后二級結(jié)構(gòu)在約175～190氨基酸處的含量升高，具體表現(xiàn)為β-折疊和β-轉(zhuǎn)角較突變前各增加一個(gè)，而無規(guī)則卷曲較突變前發(fā)生了松弛，loop環(huán)平均長度增加。

2.5 突變前后三級結(jié)構(gòu)的比較

圖4 超嗜熱α-淀粉酶186位點(diǎn)三級結(jié)構(gòu)突變前后放大圖Fig. 4 Three-dimensional structures of T. siculi HJ21α-amylase with and without mutation

通過Swiss-model構(gòu)建T. siculi HJ21α-淀粉酶突變前后的立體結(jié)構(gòu)，突變前后α-淀粉酶的整體三維結(jié)構(gòu)基本一致，186突變位點(diǎn)位于酶分子的表面，在結(jié)構(gòu)域A的無規(guī)則卷曲上。由圖4可知，利用Deepview軟件分析186位點(diǎn)突變前后氫鍵的變化，由于186位點(diǎn)的Asp變?yōu)锳sn，氫鍵由5個(gè)變?yōu)?個(gè)，且與之形成氫鍵的氨基酸種類及氫鍵距離均發(fā)生了改變。突變前，Asp186與Tyr184(鍵間距離為His169和Asp177、Gly179形成氫鍵；突變后，186Asn分別與Tyr184(鍵間距離為、Asp177、Gly179、Ile187形成氫鍵，與His169形成的兩個(gè)氫鍵被完全斷開。同時(shí)，186位點(diǎn)和周圍氨基酸殘基的距離也發(fā)生了改變，突變前，Asp186與Asp177、 Gly179和Tyr184殘基之間的距離分別是突變后，Asn186上述氨基酸殘基之間的距離改變?yōu)?/p>

3 討 論

由實(shí)驗(yàn)得到T. siculi HJ21α-淀粉酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)還未見報(bào)道，突變效應(yīng)的分析在一定程度上受到了制約，通過模型模擬的方法預(yù)測該酶分子結(jié)構(gòu)將有助于對該酶分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的理解，認(rèn)為T. siculi HJ21 α-淀粉酶經(jīng)186Asp定點(diǎn)突變喪失生物活性的主要原因在于酶蛋白的非折疊態(tài)構(gòu)象，熵的增加破壞了該酶原有的嗜熱機(jī)制[16]。

3.1 酶蛋白一級結(jié)構(gòu)的影響

Asp186突變成Asn后，與His169的兩個(gè)帶電荷-帶電荷型氫鍵被斷開，而與Ile187形成一個(gè)非電荷-非電荷型氫鍵。Ile存在Cβ支鏈且不帶電荷，當(dāng)一級結(jié)構(gòu)通過氫鍵折疊成對活力發(fā)揮關(guān)鍵作用的螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)易產(chǎn)生較大的構(gòu)象張力[17]，此外，高溫下Asn脫氨作用導(dǎo)致的非酶促不可逆反應(yīng)也可能產(chǎn)生一定的影響[18]。

3.2 酶蛋白天然構(gòu)象的影響

T. siculi HJ21與P. woesei的同源性達(dá)87.3%，而P. woesei與BLA的同源性卻只有29%[19]，但它們的三級結(jié)構(gòu)極其相似，是由常見的二級結(jié)構(gòu)元件，如α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等，排列堆積而成，同時(shí)，還都含有典型的(α/β)8桶狀結(jié)構(gòu)(亦稱之TIM-桶)，簡言之，TIM-桶也是T. siculi HJ21α-淀粉酶具有催化活性的關(guān)鍵因素[9,20]。然而，Asp186變?yōu)锳sn的定點(diǎn)突變發(fā)生在TIM-桶結(jié)構(gòu)的非保守區(qū)，對酶蛋白催化活性中心的影響應(yīng)歸結(jié)為酶蛋白高級結(jié)構(gòu)中非共價(jià)力的變化，由于突變位點(diǎn)附近loop環(huán)的平均長度、二級結(jié)構(gòu)組件的總含量、氫鍵間的平均距離以及氨基酸殘基間的平均距離均有所增加，故突變后多肽鏈折疊時(shí)的構(gòu)象熵也得到了相應(yīng)地提高[21]。有趣的是，非電荷-非電荷型氫鍵的數(shù)量增加了，而帶電荷-帶電荷型氫鍵的數(shù)量卻減少了，這與氫鍵和蛋白耐熱性間關(guān)系的統(tǒng)計(jì)結(jié)果相吻合[22]。

4 結(jié) 論

通過生物信息學(xué)同源建模，比較了超嗜熱古菌T. siculi HJ21所產(chǎn)α-淀粉酶突變前后的分子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)氨基酸的種類、氨基酸殘基之間的距離、殘基之間形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)、二級結(jié)構(gòu)組件的含量與長度等多個(gè)因素都會對酶折疊構(gòu)象所對應(yīng)的自由能產(chǎn)生影響，即便蛋白結(jié)構(gòu)的變化極其微小，也能顯著改變酶的生物活性。

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Effect of Site-Directed Mutagenesis of Asp186 on Activity of Thermococcus siculi HJ21 α-Amylase

LU Ming-sheng1，YANG Fan1,2，HU Jian-en2，F(xiàn)ANG Yao-wei1，JIAO Yu-liang1，WANG Shu-jun1,*，LIU Shu1
(1. College of Marine Science, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China ；2. College of Food Engineering, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

In order to determine the relationship between amino acid residue at the special site and the activity of Thermococcus. siculi HJ21 α-amylase, pEt-28a-His6plasmid with TSA gene was used as a template for the site mutagenesis from Asp186 to Asn186. The activity of α-amylase with and without mutation was measured. According to the difference between per-mutant and mutant cDNA sequences, the secondary structure and three-dimensional structure of TSA protein were also predicted using DNAStar and Deepview protein analysis software. The results showed that Asp186 was of critical significance for maintaining the activity of T. siculi HJ21 α-amylase. The site-directed mutagenesis of T. siculi HJ21 α-amylase at position 186 changed the properties of secondary structure as well as hydrogen-bonding networks, thus resulting in the loss of its activity.

α-amylase；site-directed mutagenesis；TSA gene；position 186；enzymatic activity

Q71

A

1002-6630(2012)11-0200-05

2011-04-14

江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(09KJA170001)；江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2008340)；江蘇省高校自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(08KJB550001)

呂明生(1963—)，男，副教授，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：mingshenglu@hotmail.com

*通信作者：王淑軍(1965—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ笪⑸锛捌浠钚晕镔|(zhì)。E-mail：shujunwang86@163.com