陳 倩，李沛軍，孔保華

拉曼光譜技術(shù)在肉品科學(xué)研究中的應(yīng)用

陳 倩，李沛軍，孔保華*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

拉曼光譜技術(shù)作為新穎的光譜檢測(cè)技術(shù)在物質(zhì)理化結(jié)構(gòu)分析方面得到了廣泛應(yīng)用。該技術(shù)能實(shí)現(xiàn)對(duì)肉的快速、無(wú)損檢測(cè)，是肉品成分分析的技術(shù)之一，并且其光譜對(duì)水等極性物質(zhì)極其不敏感，因此在肉品研究中具有良好的應(yīng)用前景。本文簡(jiǎn)述拉曼光譜技術(shù)的基本原理及分類，綜述其在肉品成分分析和品質(zhì)評(píng)定方面的應(yīng)用，并對(duì)該技術(shù)在今后肉品科學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)行展望。

拉曼光譜；肉品科學(xué)；成分分析；品質(zhì)鑒定

拉曼光譜(Raman spectroscopy)技術(shù)是一門基于拉曼散射效應(yīng)而發(fā)展起來(lái)的光譜分析技術(shù)，可提供分子的振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)信息。拉曼光譜技術(shù)同化學(xué)分析技術(shù)和其他光譜技術(shù)相比，具有快速原位無(wú)損傷檢測(cè)，樣品不需處理，使用樣品量少等特點(diǎn)[1]。隨著拉曼光譜技術(shù)的發(fā)展[2]，其已被廣泛應(yīng)用到石油化工[3]、生物醫(yī)藥[4]、考古藝術(shù)[5]和法醫(yī)鑒定[6]等領(lǐng)域。基于拉曼光譜技術(shù)的諸多優(yōu)點(diǎn)，其在肉品中也得到了應(yīng)用。本文從拉曼光譜技術(shù)的原理出發(fā)，綜述該技術(shù)在肉品成分分析和品質(zhì)評(píng)定中的應(yīng)用，為將來(lái)開(kāi)發(fā)相應(yīng)的在線檢測(cè)設(shè)備提供基礎(chǔ)。

1 拉曼光譜技術(shù)的原理

拉曼光譜原理是拉曼散射效應(yīng)，它是分子對(duì)光子的一種非彈性散射效應(yīng)。處于基態(tài)的樣品分子受到能量為hv0外來(lái)光子的激發(fā)后，其能態(tài)上升至一個(gè)不穩(wěn)定的中間狀態(tài)，樣品分子在離開(kāi)這個(gè)中間狀態(tài)時(shí)隨機(jī)輻射光子。激發(fā)光的光子與物質(zhì)分子相碰撞，可產(chǎn)生彈性碰撞和非彈性碰撞。在彈性碰撞過(guò)程中，二者未發(fā)生能量交換，光子頻率保持恒定，這種散射現(xiàn)象稱為瑞利散射，如圖1a所示。在非彈性碰撞過(guò)程中，光子與分子有能量交換，光子轉(zhuǎn)移一部分能量給散射分子，或者從散射分子中吸收一部分能量，從而使其頻率改變，它取自或給予散射分子的能量只能是分子兩定態(tài)之間的差值△E＝E1－E2，而不同的化學(xué)鍵或基團(tuán)有不同的振動(dòng)能級(jí)，△E可反映指定能級(jí)的變化。因此，與之相應(yīng)的光子頻率變化也是具有特征性的，根據(jù)光子頻率變化就可以判斷出分子中所含有的化學(xué)鍵或基團(tuán)，這就是拉曼光譜可以分析分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。當(dāng)光子把一部分能量交給分子時(shí)，光子則以較小的頻率散射出去，稱為斯托克斯散射，散射分子接受的能量轉(zhuǎn)變成為分子的振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)能量，從而處于激發(fā)態(tài)E1，如圖1b所示，這時(shí)的光子的頻率為ν＇＝ν0－Δν；當(dāng)分子已經(jīng)處于振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)的激發(fā)態(tài)E1時(shí)，光子則從散射分子中取得了能量ΔE(振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)能量)，以較大的頻率散射，稱為反斯托克斯散射，這時(shí)的光子的頻率為ν＇＝ν0＋Δν。這兩種散射均屬于拉曼散射。

表1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中有用的拉曼振動(dòng)模式[7]Table 1 Raman modes useful in interpretation of protein structure[7]

由于斯托克斯散射比反斯托克斯散射強(qiáng)的多，因此光譜儀檢測(cè)的主要是斯托克斯散射。其拉曼頻移、拉曼強(qiáng)度及線寬反映的是拉曼樣品池中散射物質(zhì)的特性，與物質(zhì)分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)有關(guān)。從特征拉曼頻率可以確定分子中的原子團(tuán)和化學(xué)鍵的存在，從相對(duì)強(qiáng)度的變化能夠確定化學(xué)鍵的含量，而物質(zhì)化學(xué)環(huán)境的變化則會(huì)引起拉曼特征頻率的微小位移，從特征頻率位移的大小和方向能判定原子團(tuán)和化學(xué)鍵所處化學(xué)環(huán)境的變化[7]。拉曼光譜對(duì)對(duì)稱結(jié)構(gòu)分子檢測(cè)很有效，與紅外光譜在分析分子結(jié)構(gòu)中互相補(bǔ)充，一些基團(tuán)紅外吸收很弱，但拉曼散射卻很強(qiáng)，如C—C、C＝C、N＝N和S—S等基團(tuán)。另外，水的紅外吸收很強(qiáng)，但它的拉曼散射卻很弱，因此拉曼光譜技術(shù)特別適合水溶液體系[8]。

隨著激光技術(shù)的發(fā)展，拉曼光譜技術(shù)也發(fā)展了多種分析技術(shù)，如傅里葉變換拉曼光譜技術(shù)、表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)、激光拉曼光譜技術(shù)和共焦顯微拉曼光譜技術(shù)等[9]。

2 拉曼光譜技術(shù)在肉品成分分析中的應(yīng)用

從肉的化學(xué)組成上分析，主要有蛋白質(zhì)、脂肪、水分、浸出物、維生素和礦物質(zhì)6種。其中蛋白質(zhì)和脂肪對(duì)肉的品質(zhì)影響較顯著，如肌肉蛋白對(duì)肉品的質(zhì)地和保水性有直接影響，肌肉內(nèi)脂肪的含量會(huì)影響肉的風(fēng)味和嫩度。

2.1 對(duì)肉中蛋白質(zhì)的檢測(cè)

蛋白質(zhì)對(duì)肌肉食品的組織特性及功能特性有著重要的貢獻(xiàn)，決定著終產(chǎn)品的品質(zhì)。蛋白質(zhì)的功能特性(溶解性、凝膠性和持水性等)和組織特性與其高級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，主要包括二級(jí)結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲等)、三級(jí)結(jié)構(gòu)(二級(jí)結(jié)構(gòu)的空間作用)和四級(jí)結(jié)構(gòu)(亞基間的相互作用)。這些結(jié)構(gòu)通過(guò)不同類型的相互作用來(lái)維持氫鍵、疏水相互作用、靜電力以及范德華力等[10]。

圖1 瑞利和拉曼散射示意圖Fig.1 Schematic diagram of Rayleigh and Raman scattering

2.1.1 蛋白質(zhì)拉曼光譜譜帶的指認(rèn)

拉曼譜帶可以提供蛋白質(zhì)化學(xué)基團(tuán)變化的信息，利用這些信息可以預(yù)測(cè)溶液、固體、凝膠或結(jié)晶狀態(tài)的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和微環(huán)境。Li-Chan[7]、Herrero[10]等基于早期的研究結(jié)果對(duì)蛋白質(zhì)拉曼光譜圖中的譜帶進(jìn)行了指認(rèn)與分析，酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ的骨架振動(dòng)模式和氨基酸側(cè)鏈(胱氨酸和半胱氨酸的S—S和S—H伸縮振動(dòng))以及C—C伸縮振動(dòng)等模式反映了二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化；酪氨酸、色氨酸雙峰以及和苯丙氨酸等芳香族氨基酸殘基的振動(dòng)可以反映微環(huán)境的變化，相關(guān)各個(gè)譜帶指認(rèn)見(jiàn)表1。在肌肉食品體系中，蛋白質(zhì)這些結(jié)構(gòu)的變化可為研究其腐敗變質(zhì)的機(jī)理提供信息，進(jìn)而改善其處理、加工和貯藏條件。

2.1.2 從肌肉中分離出的蛋白質(zhì)的檢測(cè)

拉曼光譜技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到了分離出的肌原纖維蛋白和基質(zhì)蛋白結(jié)構(gòu)的測(cè)定中，這些蛋白對(duì)肌肉的組織和功能特性有著重要的貢獻(xiàn)，但是特別易受加工處理以及貯藏條件的影響。肌肉中的肌原纖維蛋白主要包括肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、肌原蛋白和原肌球蛋白等。其中肌球蛋白占主導(dǎo)，它是一種非對(duì)稱蛋白，由頭部和一部分尾部構(gòu)成的重酶解肌球蛋白和尾部的輕酶解肌球蛋白兩部分構(gòu)成。Carew等[11]利用拉曼光譜技術(shù)確定并研究了從兔肉中分離出的肌球蛋白結(jié)構(gòu)。酰胺Ⅲ區(qū)域(1265cm-1和1304cm-1)中α-螺旋構(gòu)象的譜帶對(duì)應(yīng)肌球蛋白的尾部結(jié)構(gòu)，1244cm-1處指認(rèn)為β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的譜帶以及1265cm-1處的肩峰譜帶對(duì)應(yīng)肌球蛋白的頭部結(jié)構(gòu)。Sultanbawa等[12]從鱈魚(yú)中提取了肌動(dòng)球蛋白，研究其在添加抗凍保護(hù)劑后結(jié)構(gòu)的變化。拉曼光譜結(jié)果表明，添加抗凍保護(hù)劑后進(jìn)行凍藏的肌動(dòng)球蛋白，其酰胺Ⅰ、酰胺Ⅲ以及C—C伸縮振動(dòng)有變化，表明了其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。這些結(jié)果為利用拉曼技術(shù)研究肌原纖維蛋白的構(gòu)象提供了信息。

膠原蛋白是結(jié)締組織中主要的蛋白，含有大量的甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸，它的結(jié)構(gòu)對(duì)肌肉的質(zhì)構(gòu)特性有影響。Badii等[13]分別從新鮮的和解凍后的鱈魚(yú)結(jié)締組織中提取膠原蛋白，研究?jī)霾貤l件、甲醛以及魚(yú)油對(duì)膠原蛋白的影響。結(jié)果表明，凍結(jié)的膠原蛋白添加甲醛或者魚(yú)油后貯藏在－10℃條件下，酰胺Ⅰ區(qū)域(1660cm-1)強(qiáng)度的增加表明了其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

2.1.3 肌肉中蛋白質(zhì)的檢測(cè)

基于拉曼光譜可以進(jìn)行無(wú)損原位檢測(cè)的特點(diǎn)，可將其直接應(yīng)用到未經(jīng)處理的肉樣上，研究食品體系中天然蛋白質(zhì)的相互作用以及構(gòu)象改變。Careche[14]、Herrero[15]等利用拉曼光譜技術(shù)對(duì)凍藏期間的魚(yú)肉蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了原位檢測(cè)。Careche等[14]研究表明新鮮狗鱈魚(yú)(hake)魚(yú)肉與在－10℃和－30℃條件下凍藏10個(gè)月后的Hake魚(yú)肉的拉曼光譜存在差異，在－10℃條件下蛋白結(jié)構(gòu)變化更顯著。比較新鮮的和凍藏的魚(yú)肉酰胺Ⅰ譜帶(1650～1680cm-1)發(fā)現(xiàn)，冷凍的魚(yú)肉拉曼光譜波峰向高波數(shù)方向移動(dòng)，推測(cè)這與α-螺旋結(jié)構(gòu)含量的減少有關(guān)，同時(shí)伴隨著酰胺Ⅲ譜帶(1240～1225cm-1)強(qiáng)度的增加，說(shuō)明β-折疊構(gòu)象含量增加，另外759cm-1強(qiáng)度的減弱，說(shuō)明包埋的色氨酸殘基暴露了。Herrero等[15]也研究了在同樣的凍藏溫度(－10℃和－30℃)下狗鱈魚(yú)肌肉蛋白的結(jié)構(gòu)變化，圖譜結(jié)果顯示，酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ在940cm-1處譜帶發(fā)生了變化以及色氨酸譜帶(759cm-1)強(qiáng)度的減弱，這些現(xiàn)象說(shuō)明了α-螺旋向β-折疊構(gòu)象的轉(zhuǎn)化，這與Careche等[14]的研究結(jié)果一致。

2.1.4 凝膠特性的分析

由于凝膠對(duì)肌肉食品的品質(zhì)起著關(guān)鍵性的作用，所以研究其在加工和貯存過(guò)程中，因外界環(huán)境的改變而引起的變化是很必要的。以下是拉曼光譜技術(shù)在肌肉蛋白質(zhì)凝膠和肉糜凝膠特性測(cè)定中的應(yīng)用。

2.1.4.1 蛋白質(zhì)凝膠特性的分析

肌肉蛋白凝膠是決定肉品品質(zhì)的關(guān)鍵因素，對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)、組織結(jié)構(gòu)、保水性和與食品中其他成分的交互作用有重要作用[16]，因此許多研究將肌肉蛋白從肌肉中分離出來(lái)并制備成凝膠，利用拉曼光譜技術(shù)研究分離出的蛋白的凝膠特性。Xu Xinglian等[17]研究了溫度對(duì)豬肉肌原纖維蛋白凝膠特性的影響，并確定了凝膠結(jié)構(gòu)變化與功能特性間的關(guān)系，結(jié)果表明，隨著溫度的升高α-螺旋含量降低，伴隨著β-折疊含量的顯著增加，同時(shí)二硫鍵構(gòu)象發(fā)生變化，疏水相互作用也參與其中，這些變化對(duì)形成較硬而具有不可逆性的凝膠有很大的貢獻(xiàn)，并且確定了50～60℃是豬肉肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的關(guān)鍵區(qū)域。此外，Chen等[18]采用了拉曼光譜研究了微生物轉(zhuǎn)谷酰胺酶對(duì)豬肉肌原纖維蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的變化，添加轉(zhuǎn)谷酰胺酶后凝膠光譜圖表明，α-螺旋含量減少，伴隨著β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲含量的增加，這些變化會(huì)形成強(qiáng)而不可逆的熱誘導(dǎo)凝膠。

豬血是屠宰廠中的主要副產(chǎn)物，其中血漿蛋白因其良好的凝膠特性而受到重視Davila等[19]借助拉曼光譜分析技術(shù)研究了存在于血漿中的3種主要蛋白質(zhì)(纖維蛋白原、白蛋白和球蛋白)熱誘導(dǎo)凝膠過(guò)程中的相互作用，通過(guò)圖譜可知，在凝膠過(guò)程中纖維蛋白原和白蛋白發(fā)生了相互作用，造成纖維蛋白原二硫鍵構(gòu)象變化，疏水基團(tuán)包埋以及β-折疊構(gòu)象含量減少等變化；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，纖維蛋白原可以減少熱誘導(dǎo)凝膠過(guò)程中α-螺旋含量減少程度；白蛋白與球蛋白間的相互作用使得二硫鍵增多，疏水殘基暴露，并且當(dāng)混合物中球蛋白含量居多時(shí)，其構(gòu)象受白蛋白的影響，盡管其他質(zhì)構(gòu)特性會(huì)有所改變，但熱力學(xué)性質(zhì)不受影響。

2.1.4.2 肉糜凝膠特性的分析

隨著肉糜制品的發(fā)展，對(duì)肉糜凝膠特性的研究也逐漸多了起來(lái)。Liu Ru等[20]采用拉曼光譜技術(shù)研究了魚(yú)肉和豬肉兩種不同肉糜經(jīng)不同溫度處理后其熱誘導(dǎo)凝膠的構(gòu)象及分子間相互作用的變化。通過(guò)光譜圖中指認(rèn)為二硫鍵的譜帶(500～550cm-1)、酪氨酸雙峰比值的變化，對(duì)應(yīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ譜帶的變化，以及脂肪族氨基酸C—H振動(dòng)等變化說(shuō)明隨著溫度的升高，疏水交互作用先升高后降低。對(duì)于魚(yú)肉而言，二硫鍵的形成主要是在70～80℃范圍內(nèi)，而豬肉是在50～60℃范圍內(nèi)；對(duì)于魚(yú)肉而言，4～40℃誘導(dǎo)可以形成大量的非二硫共價(jià)交聯(lián)，而豬肉不能形成。此外，Sanchez-Gonzalez等[21]研究了魚(yú)肉由肉糜變成溶膠再到凝膠的過(guò)程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，表明其變化主要表現(xiàn)在酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ中α-螺旋、β-折疊構(gòu)象變化、酪氨酸雙峰比值改變以及脂肪族氨基酸C—H波峰的移動(dòng)等方面，這些變化對(duì)形成黏而有彈性的凝膠有貢獻(xiàn)。

膳食纖維具有很強(qiáng)的吸水能力或與水結(jié)合的能力，可以賦予肉制品很好的質(zhì)構(gòu)特性，并且具有預(yù)防心血管疾病和癌癥等疾病的作用。Sanchez-Gonzalez等[22]通過(guò)向魚(yú)糜中添加小麥膳食纖維(WDF)，研究其對(duì)魚(yú)糜凝膠的影響。結(jié)果圖譜中—CH峰波向高波數(shù)方向移動(dòng)，并且伴隨著峰強(qiáng)度的降低，這些表明WDF發(fā)生了水合作用，因?yàn)樵隰~(yú)糜形成凝膠過(guò)程中，WDF結(jié)合了凝膠中的水。由于WDF的水合作用，纖維既獲得了蛋白凝膠中的水分，使蛋白質(zhì)形成了β-折疊以及疏水相互作用，又做了脫水劑。另外，經(jīng)添加WDF和加熱協(xié)同作用，易于形成β-轉(zhuǎn)角，這對(duì)形成非特異性聚集有貢獻(xiàn)。另外，膳食纖維使得溶膠狀態(tài)的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，特別是疏水側(cè)鏈的微環(huán)境的變化，使其暴露在溶液中的量增多，同時(shí)—CH強(qiáng)度的減弱也表明了蛋白質(zhì)和纖維素間發(fā)生了疏水相互作用。這些結(jié)果對(duì)添加纖維素的重組魚(yú)糜制品的研究具有一定的意義。

2.2 對(duì)肉中脂肪的檢測(cè)

脂肪是影響肌肉食品品質(zhì)的重要因素，它不僅是風(fēng)味物質(zhì)的前體，也是引起氧化變質(zhì)的主要成分。肉的氧化變質(zhì)取決于脂肪酸的不飽和程度[23]，具有高不飽和度脂肪酸的肉制品容易發(fā)生脂肪氧化，形成腐敗味。因此控制不飽和脂肪酸的含量可以有效地避免在貯藏和加工過(guò)程中肉品的氧化問(wèn)題。Lo Fiego等[24]指出，腌肉制品對(duì)原材料的要求很嚴(yán)格，需要控制原材料的碘值，否則會(huì)引起終產(chǎn)品的酸敗。因此，要對(duì)脂肪含量以及脂肪酸組成進(jìn)行研究。

在拉曼光譜中，脂肪結(jié)構(gòu)的變化主要通過(guò)以下一些譜帶來(lái)反映[25]:—CH伸縮振動(dòng)、C＝O伸縮振動(dòng)、—CH2剪切振動(dòng)以及C—C伸縮振動(dòng)等。脂肪的氧化以及脂肪同其他成分(比如蛋白質(zhì))作用等都會(huì)引起結(jié)構(gòu)的變化。另外，可以通過(guò)1660cm-1處的C＝C伸縮譜帶與1750cm-1處的C＝O伸縮譜帶或者1445cm-1處的—CH2剪切振動(dòng)譜帶的比值來(lái)定量分析脂肪的不飽和度。

3 拉曼光譜技術(shù)在肉品品質(zhì)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

肉在加工、貯藏過(guò)程中，其主要成分蛋白質(zhì)和脂肪等大分子都會(huì)發(fā)生變化，伴隨著其功能性和組織特性的變化，進(jìn)而影響其風(fēng)味、色澤、質(zhì)地和保水性等品質(zhì)方面的變化，通過(guò)拉曼光譜圖可以定性地分析肉品中這些成分的分子結(jié)構(gòu)和各種基團(tuán)之間的關(guān)系，進(jìn)而檢測(cè)肉品的品質(zhì)，此外還可以根據(jù)拉曼光譜峰強(qiáng)度與被測(cè)物質(zhì)濃度成正比的關(guān)系進(jìn)行半定量分析。

3.1 肉色成分分析

肉色是肉質(zhì)評(píng)定的重要指標(biāo)之一。肉色主要取決于肉中肌紅蛋白(myoglobin，Mb)和血紅蛋白(hemoglobin，Hb)兩大色素蛋白的含量及化學(xué)狀態(tài)。在放血充分的條件下，肌紅蛋白的比例可達(dá)到80%～90%，是構(gòu)成肉色的主要因素。肌紅蛋白由一條珠蛋白多肽鏈和一個(gè)血紅素輔基(heme group)結(jié)合而成的復(fù)合蛋白質(zhì)，它的呈色作用源于其分子內(nèi)的亞鐵血紅素。肌紅蛋白與血紅蛋白的主要差別是前者只結(jié)合一分子的血色素，而血紅蛋白結(jié)合四分子的血紅素[26]。肌紅蛋白在可見(jiàn)區(qū)420nm波長(zhǎng)處有一個(gè)很強(qiáng)的storet吸收帶，以及在500～600nm區(qū)域有弱的Q帶吸收，因此是共振拉曼光譜研究的一種很好的目標(biāo)分子[27]。因此，可利用拉曼光譜技術(shù)來(lái)研究肌肉中這些色素蛋白的結(jié)構(gòu)變化，為提高肉品的色澤品質(zhì)提供信息。

3.1.1 肌紅蛋白及其衍生物的測(cè)定

腌肉制品因其特殊的風(fēng)味與色澤深受消費(fèi)者喜愛(ài)，其特征性的粉紅色是腌制劑亞硝酸鹽與肌紅蛋白作用生成的一氧化氮肌紅蛋白(MbNO)所致。李濤等[28]利用納秒瞬態(tài)拉曼光譜技術(shù)研究小分子配體NO與肌紅蛋白Mb結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，通過(guò)考察MbNO光解后產(chǎn)物脫氧肌紅蛋白與反應(yīng)物MbNO的ν4特征振動(dòng)峰的強(qiáng)度比值隨激光激發(fā)功率的變化，闡述了利用納秒瞬態(tài)拉曼光譜技術(shù)研究MbNO體系中NO與脫氧肌紅蛋白結(jié)合過(guò)程的可行性。可見(jiàn)拉曼光譜技術(shù)為研究MbNO的形成過(guò)程以及檢測(cè)提供了新途徑。

腌肉色素MbNO加熱后珠蛋白變性，隨后與血紅素分離，由鮮肉的MbNO變成了蒸煮腌肉的亞硝酰血紅素化合物，對(duì)這種化合物的結(jié)構(gòu)一直存在爭(zhēng)議。Sun等[29]通過(guò)比較煮制后腌肉色素(CCMP)氧化前后拉曼光譜的變化，研究了它的結(jié)構(gòu)和氧化特性。CCMP提取物經(jīng)自然光和過(guò)氧化氫氧化后，鑒定其結(jié)構(gòu)是五位配位-亞硝酰血紅素化合物。圖譜的變化表明在自然光氧化過(guò)程中—NO基團(tuán)并沒(méi)有從Fe卟啉環(huán)分子中解離出來(lái)，但是其共振共軛結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

隨著高壓處理技術(shù)在肉制品中的廣泛應(yīng)用，使得其作用后的肉品品質(zhì)也得到了相應(yīng)的研究。Wackerbarth等[30]采用共振拉曼光譜技術(shù)研究了經(jīng)600～700MPa高壓處理后豬肉中的肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，無(wú)損傷未加壓處理的肉組織光譜圖呈現(xiàn)出Fe2+去氧肌紅蛋白的共振拉曼光譜，但是經(jīng)過(guò)加壓處理后形成了六位配位的Fe2+低自旋態(tài)的新的Mb種類，指認(rèn)這種蛋白是雙組氨酸復(fù)合物，這種結(jié)構(gòu)上的變化與血紅素電子躍遷的改變有關(guān)，這樣會(huì)影響肉色；相反，提取并經(jīng)過(guò)壓力和非加壓處理的豬肉的Mb，其水溶液的共振拉曼光譜圖中氧合肌紅蛋白的特征峰增加，這是由于溶液中有能結(jié)合O2的蛋白質(zhì)存在，經(jīng)加壓處理后提取的肌紅蛋白水溶液，氧合形式部分轉(zhuǎn)化為高鐵形式，表明了高壓使血紅素發(fā)生氧化。因此，結(jié)構(gòu)的變化不僅引起了顏色的變化，而且可能誘發(fā)不希望發(fā)生的氧化副反應(yīng)，涉及到更進(jìn)一步肉成分的變化。他們提出在氧合肌紅蛋白/去氧合肌紅蛋白比值很小之前進(jìn)行加壓處理，可以很大程度上避免以上現(xiàn)象。Tintchev等[31]也用拉曼光譜技術(shù)研究了600MPa高壓處理后的大馬哈魚(yú)(salmon)的肌紅蛋白和血紅蛋白結(jié)構(gòu)的變化，高壓處理后Met-Mb和Met-Hb發(fā)生了氧化還原反應(yīng)。

3.1.2 血紅蛋白及其衍生物的測(cè)定

亞硝酸鹽也會(huì)與血紅蛋白反應(yīng)生成亞硝基血紅蛋白，它可以代替亞硝酸鹽作為肉品的著色劑。沈高山等[32]采用顯微拉曼光譜技術(shù)研究了NaNO2與氧合血紅蛋白(HbO2)在水溶液中的相互作用，監(jiān)測(cè)到不同濃度的NaNO2對(duì)不同濃度的HbO2的反應(yīng)，血紅蛋白分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變且其濃度降低，表現(xiàn)在HbO2特征峰570cm-1與水合高鐵血紅蛋白特征峰495cm-1強(qiáng)度的比值I570/I494，以及鐵離子低自旋態(tài)與高自旋態(tài)特征峰強(qiáng)度比值I1586/I1555均減少，對(duì)Hb氧化態(tài)敏感的特征峰向低波數(shù)方向移動(dòng)，對(duì)卟啉環(huán)中心孔徑大小敏感的峰向高波數(shù)方向移動(dòng)。該研究為氧和血紅蛋白和水合高鐵血紅蛋白的結(jié)構(gòu)分析與反應(yīng)機(jī)理提供了有效參考。

目前，拉曼光譜技術(shù)主要是應(yīng)用到各種色素蛋白的結(jié)構(gòu)鑒定與分析方面，并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)對(duì)肉色的直接檢測(cè)，如果在進(jìn)行肉質(zhì)的感官特征評(píng)定時(shí)，拉曼光譜技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合，則在一定程度上可能提高在線檢測(cè)效率和實(shí)際的經(jīng)濟(jì)效益。

3.2 肉的保水性評(píng)價(jià)

保水性是肌肉受外力作用下其保持原有水分與添加水分的能力，它對(duì)肉的品質(zhì)有很大的影響，是肉質(zhì)評(píng)定時(shí)的重要指標(biāo)之一。保水力的高低可直接影響到肉的風(fēng)味、顏色、質(zhì)地和嫩度等。與傳統(tǒng)測(cè)定保水性的方法相比，拉曼光譜技術(shù)雖不能準(zhǔn)確地測(cè)定出肉的保水性，但是能夠快速地分析推測(cè)出保水性。

Pedersen等[33]利用拉曼光譜PLSR建模方法預(yù)測(cè)新鮮豬肉的滴水損失，發(fā)現(xiàn)具有良好的相關(guān)性(r＝0.95～0.98)。拉曼圖譜表明，保水性與位于876～951cm-1和3071～3128cm-1附近的譜帶有關(guān)。此外，關(guān)于凍藏對(duì)魚(yú)肉保水性的影響也有報(bào)道，Herrero等[34]研究不同凍藏溫度(－10℃和－30℃)條件下的狗鱈(hake)魚(yú)肉微觀結(jié)構(gòu)的變化與水的拉曼譜帶(3100～3500cm-1和50～600cm-1)特征，通過(guò)研究這些變化來(lái)確定其保水性。結(jié)果表明，160cm-1處譜帶增強(qiáng)與肌肉蛋白質(zhì)的構(gòu)象轉(zhuǎn)化有關(guān)，與肌肉中的水分子結(jié)構(gòu)也有關(guān)。在凍藏的過(guò)程中，νs(OH)強(qiáng)度增加可能為水分子提供了更大的結(jié)構(gòu)空間。利用拉曼光譜技術(shù)測(cè)定肉品的保水性從而實(shí)現(xiàn)屠宰當(dāng)天鮮肉的分級(jí)，具有廣闊的應(yīng)用前景。研究結(jié)果顯示，拉曼光譜對(duì)宰后早期肉的保水性具有較好的相關(guān)性。

3.3 肉中脂肪氧化的測(cè)定

拉曼光譜技術(shù)在肉品脂肪檢測(cè)方面的應(yīng)用較少，研究多集中在脂肪酸組成問(wèn)題上，并通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型來(lái)進(jìn)行定量分析。Olsen等[35]利用拉曼光譜技術(shù)快速分析并定量檢測(cè)了豬肉脂肪組織中的和處理后融化狀態(tài)的脂肪中的飽和、單不飽和、多不飽和脂肪酸以及碘值。其采用了多種建模方法進(jìn)行了定量分析和辨別。另外，他們指出拉曼技術(shù)有望用于豬肉胴體的在線檢測(cè)，在60s內(nèi)完成脂肪酸不飽和度的檢測(cè)。隨后Olsen等[36]又研究了檢測(cè)豬肉脂肪組織碘值的拉曼儀的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。結(jié)果表明，可在同一臺(tái)儀器上完成3年后測(cè)量的光譜的模式轉(zhuǎn)化。劉德燕等[37]采用多種建模方法對(duì)4種不同的動(dòng)物食品(雞肉、牛肉、羊肉和豬肉)中脂肪酸進(jìn)行了定量分析和判別。

此外，利用拉曼光譜技術(shù)還可以研究經(jīng)凍干和凍藏后的肉中脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)。Sarkardei 等[25]利用傅里葉拉曼光譜定量的分析了馬鮫魚(yú)(horse mackerel，Trachurus trachurus)和大西洋馬鮫(Atlantic mackerel，Scomber scombrus)這兩種魚(yú)的脂質(zhì)。從凍干和貯藏12周的馬鮫魚(yú)和大西洋馬鮫中提取油，圖譜中指認(rèn)為—CH2伸縮和C＝O酯伸縮的譜帶強(qiáng)度均有顯著減少。3011cm-1和2960～2850cm-1處的譜帶強(qiáng)度增加證明了上述結(jié)果，這就表明了脂質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，涉及到了—CH基團(tuán)和疏水相互作用的變化。與馬鮫魚(yú)相比， 大西洋馬鮫脂質(zhì)結(jié)構(gòu)變化更明顯，這可能是因?yàn)槠涠嘉逑┧幔‥PA）含量較高的緣故，另外大西洋馬鮫中多不飽和脂肪酸含量較高，也使得其更容易發(fā)生氧化。他們也指出了脂質(zhì)的氧化會(huì)影響魚(yú)肉肌原纖維蛋白的溶解性和提取性，這是由于分子間發(fā)生交聯(lián)作用以及疏水相互作用使得蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

3.4 肌肉嫩度與多汁性評(píng)價(jià)

肉的嫩度是重要的食用品質(zhì)之一，它是指肉在食用時(shí)口感的老嫩，反應(yīng)了肉的質(zhì)地。Beattie等[38]通過(guò)拉曼光譜技術(shù)對(duì)煮制后的牛肉進(jìn)行原位檢測(cè)，研究其蛋白結(jié)構(gòu)的變化，建立了嫩度和多汁性與拉曼光譜數(shù)據(jù)之間的聯(lián)系，結(jié)果表明其具有良好的相關(guān)性。牛肉的酰胺Ⅰ(1669cm-1)和酰胺Ⅲ(1235cm-1)兩處譜帶強(qiáng)度增加與β-折疊含量的增加有關(guān)；1445cm-1處譜帶對(duì)微環(huán)境和疏水相互作用很敏感，該處譜帶強(qiáng)度的增加表明牛肉疏水相互作用力增強(qiáng)。以上結(jié)果表明了蛋白質(zhì)中α-螺旋和β-折疊的比值以及蛋白質(zhì)環(huán)境的疏水性等對(duì)煮制牛肉的感官和質(zhì)構(gòu)特性有重要影響。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)疏水相互作用的1460～1483cm-1(—CH2和—CH3彎曲振動(dòng))區(qū)域譜帶與多汁性密切相關(guān)。

4 結(jié) 語(yǔ)

拉曼光譜技術(shù)在肉品領(lǐng)域中的應(yīng)用雖然起步較晚，但是憑借著其無(wú)需樣品前處理、快速、操作簡(jiǎn)便無(wú)損傷等優(yōu)點(diǎn)在肉品成分分析中取得了一定進(jìn)展。在食品分析檢測(cè)研究中，由于激光光源照射樣品時(shí)，有機(jī)分子吸收光子轉(zhuǎn)化為熒光分子產(chǎn)生的熒光效應(yīng)，進(jìn)而影響對(duì)拉曼光譜分析，因此對(duì)熒光背景扣除技術(shù)的研究可拓寬拉曼光譜技術(shù)的應(yīng)用范圍。另外，拉曼光譜儀器仍以高精密度、價(jià)格昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器為主，難以適應(yīng)肉類行業(yè)的發(fā)展，因此今后的研究重點(diǎn)在于研發(fā)低成本、可與其他分離、檢測(cè)設(shè)備聯(lián)用的在線檢測(cè)設(shè)備，應(yīng)用于實(shí)際的生產(chǎn)中，以期提高在線檢測(cè)肉品品質(zhì)的效率。先進(jìn)的物理化學(xué)技術(shù)在拉曼光譜以及分子生物等學(xué)科方面的應(yīng)用、拉曼光譜軟硬件技術(shù)的提高以及圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和完善，必將推動(dòng)拉曼光譜技術(shù)在肉品科學(xué)研究中的應(yīng)用。

[1]CHOI S, MA C. Structural characterization of globulin from common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) using circular dichroism and Raman spectroscopy[J]. Food Chemistry, 2007, 102(1): 150-160.

[2]NAFIE L A. Recent advances in linear and nonlinear Raman spectroscopy. Part Ⅳ [J]. Journal of Raman Spectroscopy, 2010, 41(12): 1566-1586.

[3]田高友. 拉曼光譜技術(shù)在石油化工領(lǐng)域應(yīng)用進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代科學(xué)儀器, 2009(2): 130-134.

[4]MAZUREK S, SZOSTAK R. Quantitative determination of diclofenac sodium and aminophylline in injection solutions by FT-Raman spectroscopy[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006, 40(5): 1235-1242.

[5]MADARIAGA J M. Raman spectroscopy in art and archaeology[J]. Journal of Raman Spectroscopy, 2010, 41(11): 1389-1393.

[6]BOYD S, BERTINO M F, SEASHOLS S J. Raman spectroscopy of blood samples for forensic applications[J]. Forensic Science International, 2011, 208: 124-128.

[7]LI-CHAN E C Y. The applications of Raman spectroscopy in food science[J]. Trends in Food Science and Technology, 1996, 7: 361-370.

[8]THYGESEN L G, LOKKE M M, MICKLANDER E, et al. Vibrational microspectroscopy of food. Raman vs. FT-IR[J]. Trends in Food Science and Technology, 2003, 14(1): 50-57.

[9]楊銘. 結(jié)構(gòu)生物學(xué)概論[M]. 北京: 北京醫(yī)科大學(xué)出版社, 2002: 68-72.

[10]HERRERO A M. Raman spectroscopy for monitoring protein structure in muscle food systems[J]. Food Science and Nutrition, 2008, 48(6): 512-523.

[11]CAREW E B, STANLEY H E, SEIDEL J C, et al. Studies of myosin and its proteolytic fragments by laser Raman spectroscopy[J]. Biophysical Journal, 1983, 44(2): 219-224.

[12]SULTANBAWA Y, LI-CHAN E C Y. Structural changes in natural actomyosin and surimi from ling cod (Ophiodon elongatus) during frozen storage in the absence or presence of cryoprotectans[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(10): 4716-4725.

[13]BADII F, HOWELL N K. Elucidation of the effect of formaldehyde and lipids on frozen stored cod collagen by FT-Raman spectroscopy and differential scanning calorimetry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(5): 1440-1446.

[14]CARECHE M, HERRERO A M, RODRIGUEZ-CASADO A, et al. Structural changes of hake (Merluccius merluccius L.) fillets: effects of freezing and frozen storage[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47(3): 952-959.

[15]HERRERO A M, CARMONA P, CARECHE M. Raman spectroscopic study of structural changes in hake (Merluccius merluccius L.) muscle proteins during frozen storage[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(8): 2147-2153.

[16]夏秀芳, 孔保華, 張宏偉. 肌原纖維蛋白凝膠形成機(jī)理及影響因素的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(9): 264-268.

[17]XU Xianglian, HAN Minyi, FEI Ying, et al. Raman spectroscopic study of heat-induced gelation of pork myofibrillar proteins and its relationship with textural characteristic[J]. Meat Science, 2011, 87(3): 159-164.

[18]CHEN H Y, HAN M Y. Raman spectroscopic study of the effects of microbial transglutaminase on heat-induced gelation of pork myofibrillar proteins and its relationship with textural characteristics[J]. Food Research International, 2011, 44(5): 1514-1520.

[19]DAVILA E, PARESA D, HOWELL N K. Studies on plasma protein interactions in heat-induced gels by differential scanning calorimetry and FT-Raman spectroscopy[J]. Food Hydrocolloids, 2007, 21(7): 1144-1152.

[20]LIU Ru, ZHAO Siming, XIE Bijun, et al. Contribution of protein conformation and intermolecular bonds to fish and pork gelation properties [J]. Food Hydrocolloids, 2011, 25(5): 898-906.

[21]SANCHEZ-GONZALEZ I, CARMONA P, MORENO P, et al. Protein and water structural changes in fish surimi during gelation as revealed by isotopic H/D exchange and Raman spectroscopy[J]. Food Chemistry, 2008, 106(1): 56-64.

[22]SANCHEZ-GONZALEZ I, RODRIGUEZ-CASADO A, CARECHE M, et al. Raman analysis of surimi gelation by addition of wheat dietary fibre[J]. Food Chemistry , 2009, 112(1): 162-168.

[23]CARDENIA V, RODRIGUEZ-ESTRADA M T, CUMELLA F, et al. Oxidative stability of pork meat lipids as related to high-oleic sunflower oil and vitamin E diet supplementation and storage conditions[J]. Meat Science, 2011, 88(2): 271-279.

[24]lo FIEGO D P, SANTORO P, MACCHIONI P, et al. Influence of genetic type, live weight at slaughter and carcass fatness on fatty acid composition of subcutaneous adipose tissue of raw ham in the heavy pig[J]. Meat Science, 2005, 69(1): 107-114.

[25]SARKARDEI S, HOWELL N K. The effects of freeze-drying and storage on the the FT-Raman spectra of Atlantic mackerel (Scomber scombrus) and horse mackerel (Trachurus trachurus) [J]. Food Chemistry, 2007, 103(1): 62-70.

[26]孔保華, 馬麗珍. 肉品科學(xué)與技術(shù)[M]. 北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2007: 71-73.

[27]李正強(qiáng), 卜鳳泉. 色素蛋白的共振Raman和FT-Raman光譜[J]. 光散射學(xué)報(bào), 1997, 9(2/3): 245-246.

[28]李濤, 呂榮, 于安池. 時(shí)間分辨拉曼光譜研究一氧化氮與肌紅蛋白的結(jié)合過(guò)程[J]. 物理化學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 26(1): 18-22.

[29]SUN W Q, ZHOU G H, XU X L, et al. Studies on the structure and oxidation properties of extracted cooked cured meat pigment by four spectra[J]. Food Chemistry, 2009, 115(2): 596-601.

[30]WACKERBARTH H, KUHLMANN U, TINTCHEV F, et al. Structural changes of myoglobin in pressure-treated pork meat probed by resonance Raman spectroscopy[J]. Food Chemistry, 2009, 115(4): 1194-1198.

[31]TINTCHEV F, KUHLMANN U, WACKERBARTH H, et al. Redox processes in pressurised smoked salmon studied by resonance Raman spectroscopy[J]. Food Chemistry, 2009, 112(2): 482-486.

[32]沈高山, 谷懷民, 閆天秀, 等. 亞硝酸鈉和氧合血紅蛋白反應(yīng)的拉曼光譜[J]. 中國(guó)激光, 2008, 35(9): 1432-1435.

[33]PEDERSEN D K, MOREL S, ANDERSEN H J, et al. Early prediction of water-holding capacity in meat by multivariate vibrational spectroscopy[J]. Meat Science, 2003, 65(1): 581-592.

[34]HERRERO A M, CARMONA P, GARCIA M L, et al. Ultrastructural changes and structure and mobility of myowater in frozen-stored hake (Merluccius merluccius L.) muscle: relationship with functionality and texture[J]. Journal of Agricultrural and Food Chemistry, 2005, 53(7): 2558-2566.

[35]OLSEN E F, RUKKE E,TTEN A, et al. Quantitative determination of saturated-, monounsaturated-and polyunsaturated fatty acids in pork adipose tissue with non-destructive Raman spectroscopy[J]. Meat Science, 2007, 76(4): 628-634.

[36]OLSEN E F, BAUSTAD C, EGELANDSDAL B, et al. Long-term stability of a Raman instrument determining iodine value in pork adipose tissue[J]. Meat Science, 2010, 85(1): 1-6.

[37]劉燕德, 劉濤, 孫旭東, 等. 拉曼光譜技術(shù)在食品質(zhì)量安全檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2010, 30(11): 3007-3012.

[38]BEATTIE R J, BELL S J, FARMER L J, et al. Preliminary investigation of the application of Raman spectroscopy to the prediction of the sensory quality of beef silverside[J]. Meat Science, 2004, 66(4): 903-913.

Application of Raman Spectroscopy Technique in Meat Science: A Review

CHEN Qian，LI Pei-jun，KONG Bao-hua*
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

As a novel spectral detection method, Raman spectroscopy technique has been widely used in analysis of physicochemical structure of materials. Raman spectroscopy technique is also promising for component analysis of meat with the advantages of quickness and nondestructive detection. Meanwhile, Raman spectroscopy technique has good application prospect in meat science for its spectra being extremely insensitive to polar materials such as water. In this paper, the principle and classification of Raman spectroscopy technique are introduced briefly, component analysis and quality discrimination of meat by Raman spectroscopy technique are reviewed, and finally, perspective applications of this technique in further meat research is prospected.

Raman spectroscopy；meat science；component analysis；quality discrimination

TS207.3

A

1002-6630(2012)15-0307-07

2011-07-15

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(200903012-02)；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新專項(xiàng)基金(CXZ011)

陳倩(1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。 E-mail:chenqianego7@163.com

*通信作者:孔保華(1963—），女，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。E-mail:kongbh@163.com