畢 靜

堿性β-甘露聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

畢 靜

(江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 211168)

選用魔芋粉作為碳源，豆餅粉和谷氨酸鈉作為氮源物質(zhì)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行模型驗(yàn)證和5L發(fā)酵罐生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明:最佳發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L，5L發(fā)酵罐)為魔芋粉12、豆餅粉15、酵母粉5、NaCl 84.4、谷氨酸鈉3.11、K2HPO4 1.5、MgSO4 0.3、Na2CO3 10，起始pH 9.5～10.0，堿性β-甘露聚糖酶活力最高可達(dá)到2610.1U/mL。

堿性甘露聚糖酶；培養(yǎng)基；優(yōu)化；爬坡試驗(yàn)

堿性β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是纖維素酶類中的一種，廣泛存在于自然界中。微生物來(lái)源的甘露聚糖酶具有酶活高、提取方便和成本低的特點(diǎn)，比動(dòng)植物來(lái)源的有作用pH值、作用溫度范圍和底物專一性等更為廣泛，已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)和工業(yè)用酶的主要來(lái)源[1]。但自然界中分離的微生物往往只能少量分泌堿性甘露聚糖酶，所以有研究者將微生物產(chǎn)生的堿性甘露聚糖酶基因克隆和測(cè)序，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)[2-3]。但是由于表達(dá)水平不高，目前堿性甘露聚糖酶的工業(yè)化應(yīng)用成功的較少；還有一些研究者嘗試從菌種誘變及發(fā)酵條件優(yōu)化的角度來(lái)提高酶產(chǎn)量[4]，但是這方面的研究工作偏少。本實(shí)驗(yàn)在已有的研究基礎(chǔ)上，應(yīng)用SAS軟件進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)堿性甘露聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，以提高發(fā)酵液中的堿性甘露聚糖酶活，為工業(yè)化生產(chǎn)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

嗜堿芽孢桿菌，從自然界分離得到。

1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):魔芋粉12、豆餅粉15、NaCl 80、谷氨酸鈉1、酵母粉5、K2HPO41.5、MgSO40.3、Na2CO310，起始pH值調(diào)至7.5～8.0，121℃滅菌20min，加入Na2CO3使pH值至9.5～10.0[5]。

RSM試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L):魔芋粉12、豆餅粉15、酵母粉5、K2HPO41.5、MgSO40.3、Na2CO310。

R S M試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基:將需考察的關(guān)鍵因子NaCl和谷氨酸鈉配制成一定質(zhì)量濃度的母液，再根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，吸取一定體積該母液添加到三角瓶中，余量用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)齊后，按設(shè)計(jì)要求調(diào)p H值。

1.3 儀器與設(shè)備

5L發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；L2B-40轉(zhuǎn)子流量計(jì) 浙江余姚流量?jī)x器廠。

1.4 堿性β-甘露聚糖酶活力測(cè)定

在0.9mL、質(zhì)量濃度為0.5g/100mL的槐豆膠中，加入0.1mL以pH 9.6 Gly-NaOH緩沖液作稀釋的酶液于70℃水浴中保溫10min，用DNS法測(cè)定還原糖。堿性β-甘露聚糖酶酶活力單位定義為:在上述條件下，每分鐘水解出1μmol/L相當(dāng)于D-甘露糖的還原糖基所需要的酶量為一個(gè)酶活單位。

1.55 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)

在5L發(fā)酵罐上進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。上罐條件為:優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基3L，實(shí)罐121℃滅菌20min，接種量2%，培養(yǎng)溫度37℃，起始pH9.5～10.0，通氣量1.0vvm，攪拌速率500r/min。一般發(fā)酵培養(yǎng)周期為32～36h，酶活力不再增加時(shí)，即可放罐。

1.6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.6.1 Pluckett-Burman (PB)試驗(yàn)

Pluckett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種兩水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，它基于不完全平衡塊原理，能以最少的試驗(yàn)次數(shù)從眾多變量中快速篩選出對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大的因素[6-8]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基中有起始pH值、魔芋粉、豆餅粉、酵母粉、谷氨酸鈉、NaCl、MgSO4和K2HPO4共8種成分，它們都對(duì)堿性β-甘露聚糖酶的產(chǎn)生有一定的影響。如果全部用來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。所以首先選用PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出具有顯著影響的因素。

本設(shè)計(jì)采用試驗(yàn)次數(shù)n＝12的PB設(shè)計(jì)對(duì)這8個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素取兩個(gè)水平，高水平(＋)和低水平(－)，PB試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 PB試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels used in Pluckett-Burman design

1.6.2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

最陡爬坡試驗(yàn)?zāi)茏羁毂七M(jìn)最大響應(yīng)區(qū)域，確定中心組合試驗(yàn)的中心點(diǎn)，保證響應(yīng)面分析結(jié)果的準(zhǔn)確有效性。PB試驗(yàn)得出的一次擬合方程各變量的系數(shù)決定爬坡方向和變化步長(zhǎng)，如果系數(shù)為負(fù)，則該因素水平應(yīng)為遞減，反之遞增，系數(shù)越大變化步長(zhǎng)越小[9]。

1.6.3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(CCD)

基于PB試驗(yàn)結(jié)果，以最陡爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)，本階段試驗(yàn)根據(jù)中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)(CCD)法，對(duì)影響堿性β-甘露聚糖酶的關(guān)鍵內(nèi)部因素進(jìn)行研究和探索。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)多項(xiàng)式回歸分析得到一個(gè)關(guān)于響應(yīng)值與自變量關(guān)系的二價(jià)經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?

式中:Y為預(yù)測(cè)響應(yīng)值(即堿性β-甘露聚糖酶活力)，bi為回歸系數(shù)，Xi為自變量。Xi和X0的關(guān)系公式為:

式中:Xi為自變量，X0為自變量在中心點(diǎn)時(shí)的值，ΔXi為自變量變化的步長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)均采用SAS軟件9.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作回歸擬合，對(duì)擬合方程作顯著性檢驗(yàn)及方差分析。多項(xiàng)式模型方程擬和的性質(zhì)由決定系數(shù)(R2)及方差分析判定，其統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性由F檢驗(yàn)確定。所得回歸方程(1)分別對(duì)各自變量求偏導(dǎo)數(shù)并均令其為0，即可得一個(gè)二元一次方程組，通過解此方程組就可以得到堿性β-甘露聚糖酶的最大產(chǎn)出和對(duì)應(yīng)的極值點(diǎn)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性甘露聚糖酶產(chǎn)出的關(guān)鍵影響因子的確定

根據(jù)試驗(yàn)方案，設(shè)計(jì)PB試驗(yàn)的自變量水平[11]。根據(jù)SAS軟件自動(dòng)生成的八因素二水平的組合，對(duì)原始培養(yǎng)基8種成分進(jìn)行考察，篩選影響堿性β-甘露聚糖酶產(chǎn)出的重要因素。PB試驗(yàn)結(jié)果見表2，其回歸分析見表3。

表2 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Pluckett-Burman design arrangement and corresponding experimental results

表3 PB試驗(yàn)結(jié)果的回歸分析Table 3 Regression analysis of the Pluckett-Burman experimental results

為保證結(jié)果可靠性，每個(gè)試驗(yàn)組合設(shè)置3個(gè)平行，響應(yīng)值Y為堿性β-甘露聚糖酶活力的平均值。用SAS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到一次回歸方程:

該模型方程的R2為0.9559，證明該模型極其顯著且合適有效。根據(jù)表3中t檢驗(yàn)結(jié)果可知，NaCl和谷氨酸鈉為主要影響因素，在95%和99%置信區(qū)間其可信度分別為96.76%和99.38%。

2.2 培養(yǎng)基組成對(duì)堿性β-甘露聚糖酶產(chǎn)量的影響

2.2.1 中心組合試驗(yàn)中心點(diǎn)的確定

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果可知，NaCl和谷氨酸鈉加入量為產(chǎn)堿性β-甘露聚糖酶的主要影響因素。由方程(1)可知NaCl的系數(shù)為負(fù)，說明實(shí)驗(yàn)水平下降對(duì)堿性β-甘露聚糖酶的產(chǎn)出有積極的影響；谷氨酸鈉的系數(shù)為正，說明實(shí)驗(yàn)水平上升對(duì)產(chǎn)酶有積極的影響。確定NaCl和谷氨酸鈉的變化步長(zhǎng)分別為5g/L和0.2g/L進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。魔芋粉、豆餅粉、酵母粉、K2HPO4、MgSO4、Na2CO3添加質(zhì)量濃度和起始pH值保持原水平。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示?？芍罄m(xù)中心組合試驗(yàn)的中心點(diǎn)為NaCl 85.0g/L、谷氨酸鈉3.0g/L。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 4 Steepest ascent test arrangement and corresponding experimental results

2.2.2 堿性β-甘露聚糖酶的中心組合試驗(yàn)分析與優(yōu)化

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)，對(duì)NaCl和谷氨酸鈉進(jìn)行中心試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)，魔芋粉、豆餅粉、酵母粉、K2HPO4、MgSO4、Na2CO3添加量和起始pH值保持原水平。為使擬合方程具有旋轉(zhuǎn)性和通用性，中心點(diǎn)重復(fù)4次，星號(hào)臂長(zhǎng)γ＝1.414[12-15]。自變量水平及編碼，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5，二次多項(xiàng)模型方差分析見表6，回歸方程系數(shù)及其顯著性分析見表7。

表5 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Central composite design (CCD) arrangement and corresponding experimental results

表6 二次多項(xiàng)模型方差分析表Table 6 Variance analysis of the fitted quadratic polynomial model based on CCD design

表7 回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)Table 7 Regression coefficients and their significance for the regression model based on CCD design

利用SAS9.0軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得了二次經(jīng)驗(yàn)?zāi)M方程:

二次多項(xiàng)模型方差分析確定顯著因素，由表6的方差分析結(jié)果表明，方程差異極顯著(P＝0.0001)，而且各因素系數(shù)均有意義(表7)，說明方程的顯著性及可靠性極高。

考察的NaCl和谷氨酸鈉的質(zhì)量濃度范圍分別為78～92g/L和2.4～3.6g/L時(shí)，當(dāng)NaCl 和谷氨酸鈉質(zhì)量濃度達(dá)到80～90g/L和2.8～3.6g/L 時(shí)為最適產(chǎn)酶質(zhì)量濃度。在較低質(zhì)量濃度NaCl和較高質(zhì)量濃度谷氨酸鈉時(shí)，可以達(dá)到最高酶活力，得到模型極值點(diǎn)為X1＝－0.120、X2＝0.276，對(duì)應(yīng)NaCl 84.4g/L、谷氨酸鈉3.11g/L，此時(shí)預(yù)測(cè)堿性β-甘露聚糖酶活力為2605U/mL。

2.3 模型驗(yàn)證

為驗(yàn)證模型準(zhǔn)確性和有效性，根據(jù)方程(2)得到NaCl和谷氨酸鈉的質(zhì)量濃度，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，即最佳發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):魔芋粉12、豆餅粉15、酵母粉 5、NaCl 84.4、谷氨酸鈉 3.11、K2HPO41.5、MgSO40.3、Na2CO310，起始pH 9.5～10.0進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，得到堿性β-甘露聚糖酶實(shí)際酶活力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值為2695.0U/mL，符合模型預(yù)測(cè)值(2688.5U/mL)，可見該模型能準(zhǔn)確預(yù)見實(shí)際發(fā)酵情況。

2.45 L發(fā)酵罐結(jié)果

按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基，在5L發(fā)酵罐上進(jìn)行堿性β-甘露聚糖酶生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，堿性β-甘露聚糖酶活力最高可達(dá)到2610.1U/mL，比初始培養(yǎng)基產(chǎn)酶水平(1671U/mL)提高56.2%。可見，該模型能準(zhǔn)確預(yù)見實(shí)際發(fā)酵情況，提高堿性β-甘露聚糖酶的產(chǎn)量。

3 結(jié) 論

選定魔芋粉作為碳源，豆餅粉和谷氨酸鈉作為氮源物質(zhì)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):魔芋粉12、豆餅粉15、酵母粉5、NaCl 84.4、谷氨酸鈉3.11、K2HPO41.5、MgSO40.3、Na2CO310，起始pH 9.5～10.0，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，堿性β-甘露聚糖酶活力為2695.0U/mL，符合模型預(yù)測(cè)值2688.5U/mL。在5L發(fā)酵罐上進(jìn)行堿性β-甘露聚糖酶生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，堿性β-甘露聚糖酶活最高可達(dá)到2610.1U/mL，比初始培養(yǎng)基產(chǎn)酶水平(1671U/mL)提高56.2%?？梢?，該模型能準(zhǔn)確預(yù)見實(shí)際發(fā)酵情況，提高了堿性β-甘露聚糖酶的產(chǎn)量。

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Optimization of Fermentation Medium for Alkaline Mannanase Production

BI Jing
(College of Engineering and Technology, Jiangsu Institute of Economic and Trade Technology, Nanjing 211168, China)

The fermentation medium for producing alkaline mannose using konjac flour as the carbon source and soybean cake powder and sodium glutamate as the nitrogen source was optimized by Pluckett-Burman (PB) design, steepest ascent test and central composite design. Based on a central composite design for three independent variables including NaCl and sodium glutamate concentrations, a predictive mathematical model was built and validated. Meanwhile, scale-up production experiments were done in a 5-L fermentor. Our results indicated that the optimal fermentation medium (g/L) was composed of konjac flour 12, soybean cake powder 15, yeast powder 5, NaCl 84.4, sodium glutamate 3.11, K2HPO41.5, MgSO40.3, Na2CO310, and initial pH 9.5—10.0, yielding an alkaline mannose as high as 2610.1 U/mL.

alkaline mannanase；medium；optimization；steepest ascent test

Q556.2

A

1002-6630(2012)15-0266-04

2012-03-12

畢靜(1965—)，女，工程師，本科，研究方向?yàn)槭称饭こ?。E-mail:zyz0878@139.com