張大鳳，李 可，劉 森，劉若塵，邢亞閣，李明元，車振明，向文良,*

(1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院 四川省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610039；2.西華大學(xué)古法發(fā)酵(釀造)生物技術(shù)研究所，四川 成都 610039)

中國濃香型白酒窖池糟醅中微生物群落演替分析

張大鳳1,2，李 可1,2，劉 森1,2，劉若塵1，邢亞閣1，李明元1,2，車振明1，向文良1,2,*

(1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院 四川省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610039；2.西華大學(xué)古法發(fā)酵(釀造)生物技術(shù)研究所，四川 成都 610039)

為探索中國濃香型白酒發(fā)酵糟醅中微生物群落演替規(guī)律，利用克隆分析，從時(shí)間和空間兩個(gè)層面對(duì)糟醅微生物區(qū)系的消長(zhǎng)變化進(jìn)行較為全面的調(diào)查。根據(jù)有效克隆子分布數(shù)據(jù)計(jì)算的群落多樣性參數(shù)表明:窖池糟醅微生物群落多樣性在時(shí)間和空間上存在差異。應(yīng)用CANOCO 4.5 軟件對(duì)物種和生態(tài)因子進(jìn)行典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)，應(yīng)用CANODRAW 4.0作種類、樣方分布與生態(tài)因子關(guān)系的二維排序圖，排序圖上清楚地反映了窖池糟醅微生物種類、群落分布與生態(tài)因子的關(guān)系。結(jié)果表明:酸度、乙醇含量、水分含量是影響微生物群落結(jié)構(gòu)組成的主要微生態(tài)因子；大部分微生物適宜在低酸度條件下生長(zhǎng)，少數(shù)耐酸微生物能在高酸度條件下生長(zhǎng)；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，生態(tài)因子發(fā)生變化，微生物群落也進(jìn)行相應(yīng)的演替，向耐高酒精含量、高酸度的群落發(fā)展。

中國濃香型白酒；發(fā)酵糟醅；微生物演替

中國濃香型白酒的生產(chǎn)以泥窖窖池為基礎(chǔ)，發(fā)酵過程是棲息在窖池糟醅、窖泥中的龐大微生物區(qū)系在糟醅固、液、氣三相界面的復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝過程[1-2]。在這一過程中，窖池生態(tài)因子如窖池溫度、糟醅酸度、總糖及還原糖含量、糟醅水分含量等與窖池中的微生物彼此聯(lián)系、互相促進(jìn)、互相制約、協(xié)調(diào)發(fā)展，共同構(gòu)成了窖池特定的微生物生態(tài)系統(tǒng)，并在“三流運(yùn)轉(zhuǎn)”規(guī)律的交互作用下構(gòu)成了發(fā)酵過程中窖池微生態(tài)的動(dòng)態(tài)發(fā)展和特定階段的動(dòng)態(tài)平衡[3-4]。由于環(huán)境信息的傳遞對(duì)于調(diào)控窖池微生物種類的變化、代謝產(chǎn)物的生成與積累至關(guān)重要，并決定著窖池物質(zhì)代謝和能量代謝的走向。因此，環(huán)境生態(tài)因子的變化對(duì)微生物的生長(zhǎng)、代謝影響非常大。在窖池不同空間位置和微生物生長(zhǎng)代謝的不同階段，微生物對(duì)窖池生態(tài)因子的需求都有所不同[5]。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微生物的演替活動(dòng)將引起窖池環(huán)境生態(tài)因子不斷發(fā)生變化，而這些變化又將反過來作用于窖池微生物，從而影響窖池發(fā)酵，最終導(dǎo)致窖池中各代謝產(chǎn)物成分和比例的變化，從而影響窖池濃香型白酒的產(chǎn)量及品質(zhì)[6-7]。所以，研究窖池微生物的動(dòng)態(tài)變化對(duì)于把握窖池發(fā)酵情況是很有必要。正因如此，白酒窖池生態(tài)系統(tǒng)中微生物的演替引起了廣大學(xué)者的極大興趣，但系統(tǒng)分析其演替過程，還未見報(bào)道。

本研究從生態(tài)學(xué)角度審視傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵，利用生態(tài)分析相關(guān)軟件，對(duì)中國白酒窖池糟醅中微生物群落和生態(tài)因子等相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)，以揭示伴隨發(fā)酵進(jìn)行，窖池不同空間層次糟醅中微生物群落物種多樣性變化趨勢(shì)和演替規(guī)律以及在窖池不同空間層次和不同發(fā)酵時(shí)間的糟醅中微生物群落結(jié)構(gòu)與窖池微生態(tài)因子之間的關(guān)系，尋找對(duì)糟醅微生物群落結(jié)構(gòu)起關(guān)鍵作用的生態(tài)因子，探討影響微生物群落演替的機(jī)制，為理解中國濃香型白酒發(fā)酵機(jī)理、特征風(fēng)味形成機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

分析所用的微生物群落和糟醅生態(tài)因子數(shù)據(jù)均由西華大學(xué)古法發(fā)酵(釀造)生物技術(shù)研究所提供。樣品采集于四川某著名濃香型白酒企業(yè)48號(hào)窖池，分別為窖池上、中、下層中心發(fā)酵時(shí)間1、7、6 0 d的糟醅。其中，上層糟醅樣分別記為:T01、T07、T60；中層糟醅樣分別記為:M01、M07、M60；下層糟醅樣分別記為:B01、B07、B60。所有樣品中的pH值、酸度、還原糖、總糖、乙醇、溫度、水分、乙醛、酯和蛋白質(zhì)等微生態(tài)因子依據(jù)沈怡方等[8]的相關(guān)方法測(cè)定。糟醅中微生物群落的分析參考向文良[7]、Zhang Wenxue[9]等的方法，PCR分別擴(kuò)增原核和真核微生物的16S rRNA基因和18S rRNA基因。擴(kuò)增的16S rRNA基因和18S rRNA基因再分別與pGM-T載體連接成重組質(zhì)粒后，分別導(dǎo)入感受態(tài)的E.coli DH5α構(gòu)建窖池糟醅中原核微生物的16S rRNA基因文庫和真核微生物的18S rRNA基因文庫，提取重組質(zhì)粒，基因測(cè)序分析窖池糟醅中微生物的分類學(xué)地位。窖池糟醅的生態(tài)因子數(shù)據(jù)見表1。窖池糟醅中微生物群落數(shù)據(jù)見表2，其中原核微生物代表克隆子的16S rRNA基因在GenBank(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中的接受號(hào):JQ693078～JQ693100；真核微生物代表克隆子的18S rRNA基因在GenBank中的接受號(hào):JQ693061～JQ693077。

1.2 數(shù)據(jù)分析方法

微生物群落關(guān)系的演替關(guān)系利用Origin8.0繪制。群落多樣性參數(shù)Simpson指數(shù)(D)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)、均勻度(J)的計(jì)算公式分別如下:

式中:pi為第i種物種個(gè)體數(shù)占群落總個(gè)體數(shù)的比例；S為物種總數(shù)；Hmax為H的最大值，等于lnS[10]。Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化圖用SPSS for Windows 13.0繪制。窖池糟醅中微生物群落與環(huán)境的相互作用關(guān)系利用典范對(duì)應(yīng)分析(canonical correspondence analysis, CCA)排序[11]。

表1 窖池糟醅的生態(tài)因子Table 1 Chemical composition of lees (wet weight basis)

表2 窖池糟醅樣中微生物16S rRNA和18S rRNA基因的克隆分布Table 2 Microbial categorization and abundance in fermentation lees based on the 16S rRNA and 18S rRNA analysis

2 結(jié)果與分析

2.116 S rRNA和18S rRNA基因的克

隆分析

2.1.1 上層糟醅中微生物分析

基于16S rRNA和18S rRNA分析技術(shù)表明:入窖樣獲得了22個(gè)有效克隆，發(fā)酵7d樣獲得了53個(gè)有效克隆，發(fā)酵60d樣獲得了42個(gè)有效克隆，這些克隆子代表的微生物伴隨發(fā)酵時(shí)間發(fā)生的群落演替如圖1所示。上層糟醅對(duì)原核微生物而言，入窖樣中未檢出古細(xì)菌，發(fā)酵7d樣和6 0 d樣檢出的古菌為M e t h a n o c u l l e u s屬和Methanospirillum屬；其中Methanospirillum屬只在發(fā)酵60d樣被檢出。入窖樣中，細(xì)菌、霉菌、酵母的種類和數(shù)量差異不是很大。隨著發(fā)酵進(jìn)行和糟醅理化因子的變化，糟醅中微生物群落也發(fā)生明顯變化，特別是細(xì)菌，其種類和數(shù)量發(fā)生明顯變化(圖2)。入窖樣中未出現(xiàn)的Streptococcus 屬、Acetobacter屬、Arthrobacter屬、Bacillus屬、Microbacterium屬、Erwinia屬和Rhodococcus屬均在發(fā)酵7d樣中檢出。在60d樣中，已檢測(cè)不到酵母了，因?yàn)檫@時(shí)發(fā)酵已結(jié)束，此時(shí)窖池環(huán)境惡劣，如乙醇含量度高、嚴(yán)格厭氧、酸度高，酵母無法生存[12-13]，此時(shí)在60d樣品中只有甲烷菌、霉菌、細(xì)菌。

圖1 窖池上層糟醅中微生物16S rRNA和18S rRNA基因的克隆分布圖Fig.1 Microbial categorization and abundance in the top layer of fermented lees based on the 16S rRNA and 18S rRNA analysis

2.1.2 中層糟醅中微生物分析

圖2 窖池中層糟醅中微生物16S rRNA和18S rRNA基因的克隆分布圖Fig.2 Microbial categorization and abundance in the middle layer of fermented lees based on the 16S rRNA and 18S rRNA analysis

中層樣主要是母糟，包括紅糟和糧糟，是發(fā)酵最活躍的區(qū)域[14]，微生物的種類和數(shù)量在此糟醅中發(fā)生劇烈演替。由圖2可知，入窖樣獲得了42個(gè)有效克隆，發(fā)酵7d樣獲得了133個(gè)有效克隆，發(fā)酵60d樣獲得了90個(gè)有效克隆，其數(shù)量明顯多于上層樣和下層樣。上層中的Methanoculleus屬和Methanospirillum屬在中層中沒有檢出，其他古菌也未檢出。Burkholderia屬在上層樣中演替并不活躍，但中層糟醅中盡管入窖時(shí)中未檢出，但是當(dāng)其在發(fā)酵7d時(shí)Burkholderia屬的克隆數(shù)迅速達(dá)到14個(gè)，在發(fā)酵60d時(shí)其進(jìn)一步上升，達(dá)到32個(gè)克隆，占發(fā)酵60d總克隆數(shù)的35.6%，此時(shí)Burkholderia屬成為優(yōu)勢(shì)屬。Talaromyces屬在上層樣中比較活躍，一度成為上層發(fā)酵7d糟醅中的優(yōu)勢(shì)菌。在中層糟醅中隨著發(fā)酵的進(jìn)行，Talaromyces屬中微生物數(shù)量一直遞減，在發(fā)酵7d樣和60d樣中分別只能檢測(cè)出2個(gè)和1個(gè)克隆子。Eurotium 屬、Aspergillus屬在中層中含量也比較豐富，這與中層樣中含有的糧糟有關(guān)。同樣，在中層糟醅發(fā)酵60d時(shí)也未檢出酵母。

2.1.3 下層糟醅中微生物分析

圖3 窖池下層糟醅中微生物16S rRNA和18S rRNA基因的克隆分布圖Fig.3 Microbial categorization and abundance in the bottom layer of fermented lees based on the 16S rRNA and 18S rRNA analysis

由圖3可知，在下層糟醅中入窖樣獲得了27個(gè)有效克隆，發(fā)酵7d樣獲得了44個(gè)有效克隆，發(fā)酵60d樣獲得了38個(gè)有效克隆。下層樣是多輪底糟，其酸度非常高，所以微生物種類和數(shù)量都相對(duì)較少，在發(fā)酵過程中微生物種類和數(shù)量的波動(dòng)比較平緩。下層樣另一特點(diǎn)是古菌含量豐富，包括甲烷菌M e t h a n o c u l l e u s屬和Methanospirillum屬，入窖糟醅中古菌占總菌屬的29.6%，7d為29.5%，60d為57.9%。發(fā)酵結(jié)束后，只有幾種耐酸性的細(xì)菌存在，主要為細(xì)菌中的Lactobacillus屬和TM7 phylum；霉菌和酵母在此時(shí)未被檢出。

2.2 窖池中微生物群落多樣性分析

圖4 Shannon-Wiener多樣性指數(shù)隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig.4 Temporal changes of microbial Shannon-Wiener diversity

窖池糟醅上、中、下層的入窖樣、發(fā)酵7d樣、發(fā)酵60d樣共9個(gè)樣方中分布的微生物菌群多樣性分析結(jié)果見圖4。Shannon-Wiener多樣性指數(shù)在上、中、下層糟醅中表現(xiàn)出同樣的變化趨勢(shì):隨著發(fā)酵的開始，群落多樣性增加，到發(fā)酵結(jié)束時(shí)，群落多樣性降低。發(fā)酵開始時(shí)，糟醅原料提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和適宜的生長(zhǎng)條件，各類微生物能快速生長(zhǎng)。隨著氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，代謝產(chǎn)物的積累，窖池環(huán)境變得越來越不適宜微生物的生長(zhǎng)。下層樣由于酸度最高，微生物種類最少，主要是一些耐酸的微生物能生長(zhǎng)，故其Shannon-Wiener多樣性指數(shù)在入窖樣、發(fā)酵7d樣、發(fā)酵60d樣中均低于上層樣和中層樣。中層樣是發(fā)酵最活躍的區(qū)域，也是微生物種類和數(shù)量最豐富的區(qū)域，其多樣性指數(shù)在入窖樣和發(fā)酵7d樣中均大于上層樣和下層樣。但中層樣在發(fā)酵60d樣中卻低于上層樣，可能是由于中層樣與下層樣間通過黃水的物質(zhì)交換比較頻繁，中層發(fā)酵60d樣中的酸度也比較高，導(dǎo)致微生物多樣性低于上層樣。

2.3 微生物群落演替與生態(tài)因子之間的關(guān)系

表3 窖池糟醅的微生態(tài)因子Table 3 Microecological factors in fermentation less

表4 CCA分析的統(tǒng)計(jì)信息Table 4 Statistical analysis of CCA analysis results

9個(gè)樣方的生態(tài)因子經(jīng)過處理后(表3)與微生物的種類用于CCA排序。CCA排序結(jié)果(表4)表明:軸1和軸2兩個(gè)排序軸的本征值分別為0.398和0.296；生態(tài)因子與微生物種類相關(guān)性分別為0.998和0.868；物種數(shù)據(jù)的方差累計(jì)百分?jǐn)?shù)分別為30.7和53.6；總本征值為1.294，總典范本征值為1.036，解釋量為80.06%；蒙特卡羅檢驗(yàn)值小于等于0.05，所以排序結(jié)果較好的反映了微生物種類組成與生態(tài)因子間的相互關(guān)系[15-16]。從CCA排序圖來看，酸度梯度是所有因子中對(duì)微生物群落分布起決定性作用的生態(tài)因子，大多數(shù)物種都分布在低酸度區(qū)域，如圖5所示。低酸度區(qū)域的物種多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于高酸度區(qū)域[17]。Methanoculleus(1)和Methanospirillum(2)屬對(duì)酸度的要求高，是糟醅中最耐酸的微生物，且對(duì)水分的要求也高。TM7 phylum(15)、Lactobacillus(9)和Clostridium(6)屬也能耐一定的酸度。Trichosporon(18)、Saccharomycopsis(17)、Torulaspora(23)和Issatchenkia(24)屬主要分布在還原糖/粗蛋白質(zhì)比值高、水分含量較高、乙醇含量低、低酸度、相對(duì)溫度較低的區(qū)域，其中Tri-chosporon(18)屬對(duì)水分的要求較高 。Talaromyces(16)、Staphylococcus(8)、Arthrobacter(5)、Acetobacter(4)、Bacillus (7)和Corynebacterium(10)屬，多見于具有適宜的水分含量、合適的還原糖/粗蛋白質(zhì)和低酸度的區(qū)域。Sa ccharomyces(25)、Microbacterium(12)、Erwinia(13)、Zygosaccharomyces(21)、Rhodococcus(14)和Streptococcus (3)屬，主要分布在適宜在水分含量低、溫度較高、酸度低和一定含量酒精的糟醅中。Fomitopsis(22)、Aspergillus(20)、Burkholderia(11)、Eurotium(19)和Clostridium(6)屬的微生物與糟醅乙醇含量有著極大地相關(guān)性，在較高乙醇含量條件下也能生存。

圖5 微生物物種與生態(tài)因子的CCA二維排序Fig.5 Canonical correspondence analysis based on microbial species and ecological factors

3 結(jié) 論

3.1 統(tǒng)計(jì)分析表明，在發(fā)酵不同時(shí)間、窖池糟醅不同空間層次中微生物類群和數(shù)量存在較大的差異，以中層樣居首。

3.2 通過對(duì)多樣性分析表明，窖池糟醅微生物群落多樣性隨空間和發(fā)酵時(shí)間的變化而異，具體表現(xiàn)為:入窖樣和發(fā)酵7d樣的群落多樣性分別為中層＞上層＞下層，發(fā)酵60d樣的群落多樣性為上層＞中層＞下層。在時(shí)間軸上，糟醅微生物群落多樣性呈先上升后下降的趨勢(shì)。

3.3 CCA排序結(jié)果顯示:酸度、乙醇含量、水分含量是影響微生物群落結(jié)構(gòu)組成的主要微生態(tài)因子。除了極少數(shù)耐酸的微生物，如甲烷菌，Lactobacillus屬能在較高的酸度下生存，大部分微生物生活在低酸度區(qū)域。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乙醇逐漸積累，微生物群落發(fā)生相應(yīng)的演替，向耐高酒精含量、高酸度的群落發(fā)展。

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Microbial Community Succession of Chinese Luzhou-Flavor Liquor Lees

ZHANG Da-feng1,2，LI Ke1,2，LIU Sen1,2，LIU Ruo-chen1，XING Ya-ge1，LI Ming-yuan1,2，CHE Zhen-ming1，XIANG Wen-liang1,2,*
(1. Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan, College of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China；2. Biotechnology Institute of Ancient Brewing, Xihua University, Chengdu 610039, China)

In order to explore the succession of microorganism communities in fermented grains from Chinese Luzhou-flavor liquor production, we investigated the temporal and spatial changes of microbial communities by clone analysis. The community diversity parameters calculated based on clone distribution suggested that microbial community diversity showed temporal and spatial variations. The data of species and ecological factors were analyzed by canonical correspondence analysis (CCA) using CANOCO 4.5. The species (or sites)-environment biplot of CCA were automatically mapped using CANODRAW 4.0 and the relationships of the ecological distribution of the fermented grains microorganism species and communities with the ecological factors were clearly revealed on these biplots. The results showed that the acidity, ethanol and humidity had important influences on the microbial community composition. The bulk of microorganism species adapted to grow in low acidity condition and only a few microorganisms could live in high acidity condition. The microorganism communities responded to changes of ecological factors along with fermentation, towards a community tolerant of high levels of ethanol and acidity.

Chinese Luzhou-flavor liquor；fermentation lees；community succession

TS261.1

A

1002-6630(2012)15-0183-05

2011-11-11

教育部春暉計(jì)劃項(xiàng)目(Z2010101)；四川省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(SZJJ2009-014)；

西華大學(xué)重點(diǎn)科研基金項(xiàng)目(Z0910501)

張大鳳(1973—)，女，講師，碩士研究生，研究方向?yàn)閭鹘y(tǒng)發(fā)酵食品生物技術(shù)。E-mail:yhf1998914@163.com

*通信作者:向文良(1973—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)閭鹘y(tǒng)發(fā)酵食品微生物過程學(xué)。E-mail:biounicom@mail.edu.cn