劉 晶，時(shí) 敏，徐 速，于殿宇，江連洲，任運(yùn)宏*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的菌株篩選及其應(yīng)用

劉 晶，時(shí) 敏，徐 速，于殿宇，江連洲，任運(yùn)宏*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

采用從大慶日月星油廠附近的土壤中篩選得到產(chǎn)脂肪酶的菌株χjA，在固態(tài)發(fā)酵的條件下生產(chǎn)脂肪酶，并將所產(chǎn)脂肪酶應(yīng)用于合成共軛亞油酸甘油酯。本實(shí)驗(yàn)利用單因素和正交試驗(yàn)方法確定產(chǎn)脂肪酶的最佳固態(tài)發(fā)酵條件：在種齡36h的情況下，碳源(麩皮)與氮源(豆粕)質(zhì)量比(m麩皮:m豆粕)為1:4、V培養(yǎng)基:V加水量 1:1、接種量0.3%、發(fā)酵溫度29℃、發(fā)酵時(shí)間3d。在此條件下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，固態(tài)培養(yǎng)基中脂肪酶的活力最高，可達(dá)1450U/g；所得脂肪酶用于合成共軛亞油酸甘油酯，產(chǎn)物中共軛亞油酸(CLA)接入率可達(dá)到13.6%。

脂肪酶；固態(tài)發(fā)酵；酶活力；共軛亞油酸甘油酯；

脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)，又稱甘油酯水解酶，可作用于脂肪分子中的羧酸酯鍵，催化脂肪水解為脂肪酸和二酰甘油、單酰甘油或甘油，也可催化甘油酯及水不溶性酯類的醇解、酯化、酯交換以及合成等反應(yīng)[1-2]。催化反應(yīng)不需要輔酶，且反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少，反應(yīng)通常具有高度立體異構(gòu)專一性和化學(xué)選擇性[3-4]。

與國(guó)外相比，我國(guó)對(duì)脂肪酶的研究和開發(fā)較晚，而且工業(yè)化的微生物脂肪酶制劑種類有限，但產(chǎn)脂肪酶的微生物在自然界中分布很廣，據(jù)估計(jì)，有65個(gè)屬的微生物能產(chǎn)脂肪酶，而實(shí)際上產(chǎn)脂肪酶的微生物在自然界的分布遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過于此[5]。因此，篩選具有新特性的活力高、產(chǎn)量高及成本低的脂肪酶菌種，同時(shí)開發(fā)脂肪酶新的應(yīng)用領(lǐng)域是十分必要的。隨著遺傳工程的應(yīng)用，酶的固定化技術(shù)及界面酶學(xué)和非水酶學(xué)的研究與應(yīng)用，微生物脂肪酶將使諸多的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)面臨新的挑戰(zhàn)[6]。

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是由亞油酸衍生的一組亞油酸異構(gòu)體，是普遍存在于人和動(dòng)物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。由于自然界中CLA的含量較低，不能滿足人們的需求。目前CLA的合成，一般以亞油酸或富含亞油酸的植物油如葵花籽油、蓖麻油或紅花籽油等為原料，采用化學(xué)、生物的方法進(jìn)行異構(gòu)化[7]。常見的制備方法主要有：堿性異構(gòu)化法、混合溶劑法、酶催化亞油酸異構(gòu)化法、羥基脂肪酸脫水以及近年來興起的在超臨界CO2狀態(tài)下酶法合成CLA、微生物合成法等[8-11]。共軛亞油酸不僅具有多種生理功能還具備一定的保健作用[12]。近年來，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)酶法制備共軛亞油酸甘油酯的研究較多，酶法相對(duì)于化學(xué)法成本較高，但由于反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)過程中無有機(jī)溶劑的加入，是一種綠色的生產(chǎn)方法。

由于國(guó)內(nèi)產(chǎn)脂肪酶的方法大多還是液態(tài)產(chǎn)脂肪酶，固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的報(bào)道較少，因此，本實(shí)驗(yàn)充分利用廉價(jià)農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物，降低脂肪酶原料生產(chǎn)成本；利用固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶，相對(duì)液體深層發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶，節(jié)約設(shè)備投資和生產(chǎn)運(yùn)行費(fèi)用等優(yōu)勢(shì)。從大慶日月星油廠附近采集到的土樣中分離篩選到一株產(chǎn)脂肪酶菌株，利用豆粕、麩皮為原料固態(tài)發(fā)酵制備脂肪酶。在實(shí)驗(yàn)室水平上，摸索一套適宜固態(tài)發(fā)酵脂肪酶的工藝條件，為應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)共軛亞油酸甘油酯提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

菌種：從大慶日月星油廠附近采集的土樣中分離純化而來，根據(jù)菌落生長(zhǎng)速度較快，菌落顏色起初白色、黃色，后變?yōu)榈G褐色，直徑3～4cm，分生孢子頭放射狀，頂囊近球形，生長(zhǎng)最適溫度為30℃左右，40℃時(shí)仍能生長(zhǎng)[13-14]，初步鑒定為產(chǎn)脂肪酶的實(shí)驗(yàn)用菌株χjA。

花生油，魯花5S壓榨一級(jí)花生油；共軛亞油酸 青島澳海有限公司；橄欖油 廣東雅娜集團(tuán)有限公司；酵母膏、蛋白胨、瓊脂 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海公司；其余試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

脂肪酶篩選培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO41、K2HPO41、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01、瓊脂18，橄欖油-聚乙烯醇乳化液(體積比1:3)混合液。

種子培養(yǎng)基：豆餅粉4g、淀粉0.6g、Na2HPO40.2g、K2SO40.3g、MgSO40.3g、FeSO40.015g、CaCO30.5g，自來水100mL，并調(diào)節(jié)pH值至7.5，121℃滅菌20min。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：將新鮮的麩皮粉碎后和豆粕按一定質(zhì)量比混合，然后加入到250mL三角燒瓶中，再加入一定比例的自來水，攪和均勻后121℃高壓滅菌15min，備用。

1.3 儀器與設(shè)備

無菌超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海醫(yī)用核子儀器廠；恒溫培養(yǎng)箱 廣東儀器廠；移液器 德國(guó)艾本德股份公司；電子天平 上海民橋精密儀器有限公司；低溫高速離心機(jī) 日本日立公司；夾套式具塞反應(yīng)器 自制。

1.4 方法

1.4.1 粗酶液的制備

取30g鮮曲，加蒸餾水150mL，將酶曲充分搗碎后(組織搗碎機(jī)搗碎)于4℃條件下緩慢攪拌，浸提2h，4層紗布過濾，4400r/min離心20min，后的上清液即為粗酶液。

1.4.2 酶活力測(cè)定

采用改進(jìn)的橄欖油乳化法[15]定量測(cè)定。以分解底物(橄欖油)釋放出1μmol/min游離脂肪酸所需酶量定義為1個(gè)堿性脂肪酶活力單位(U) 。

1.4.3 固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

選擇麩皮和豆粕為培養(yǎng)基的碳源和氮源，將種齡為36h的菌液以一定接種量接種到發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間一定及麩皮和豆粕不同質(zhì)量比混合的培養(yǎng)基中，發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶，并對(duì)固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行旋轉(zhuǎn)正交試驗(yàn)優(yōu)化。

1.4.4 共軛亞油酸總接入率的測(cè)定分析[16]

稱取反應(yīng)后產(chǎn)物50mg置于10mL試管內(nèi)，加入0.4mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液2mL，置于漩渦混勻器上混勻15s。加入10mL色譜純正己烷后置于漩渦混勻器上30s，靜置20min后取上層清液。以供氣相色譜分析，采用面積歸一化法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 固態(tài)發(fā)酵條件的確定

2.1.1 碳氮比對(duì)產(chǎn)脂肪酶的影響

影響產(chǎn)脂肪酶的主要因素有培養(yǎng)基中碳氮比、發(fā)酵時(shí)間及發(fā)酵溫度等因素，本實(shí)驗(yàn)選擇麩皮和豆粕為培養(yǎng)基的碳源和氮源，在接種量0.3%、發(fā)酵溫度29℃、V培養(yǎng)基:V加水量1:1、發(fā)酵時(shí)間3d的條件下，通過添加不同比例的麩皮和豆粕，考察培養(yǎng)基中碳氮比對(duì)脂肪酶活力的影響，結(jié)果見表1。

表1 不同碳氮比對(duì)產(chǎn)脂肪酶的影響Table 1 Effect of wheat bran/soybean meal mass ratio on lipase production

由表1可知，該菌株在較低的碳氮比條件下可產(chǎn)生較高酶活的脂肪酶，且在m麩皮:m豆粕為1:4時(shí)酶活力最高，達(dá)到1450U/g，故應(yīng)選擇m麩皮:m豆粕(即碳氮比)為1:4為發(fā)酵的最佳碳氮比。

2.1.2 培養(yǎng)基含水量對(duì)產(chǎn)脂肪酶的影響

在碳氮比1:4、接種量0.3%、發(fā)酵溫度29℃、發(fā)酵時(shí)間3d時(shí)，通過添加不同含量的水分，考察培養(yǎng)基含水量對(duì)脂肪酶活力的影響，結(jié)果見表2。

表2 培養(yǎng)基含水量對(duì)產(chǎn)脂肪酶的影響Table 2 Effect of water content on lipase production

固態(tài)發(fā)酵中加水量過多不利于培養(yǎng)基的通氣和散熱，而加水較少無法滿足所需要的濕度。由表2可知，培養(yǎng)基與加水量的體積比為1:1，此時(shí)所得脂肪酶相對(duì)酶活最高。

2.1.3 接種量對(duì)產(chǎn)脂肪酶的影響

在碳氮比1:4、V培養(yǎng)基:V加水量1:1、發(fā)酵溫度29℃、發(fā)酵時(shí)間3d條件下，考察不同接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響，并在培養(yǎng)3d后進(jìn)行取樣測(cè)定酶活，以此考察接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 接種量對(duì)產(chǎn)脂肪酶的影響Fig. 1 Effect of inoculation amount on lipase activity

由圖1可知，當(dāng)接種量較低時(shí)由于菌體數(shù)量有限導(dǎo)致產(chǎn)脂肪酶的速度慢，故酶活力較低，當(dāng)接種量為0.3%時(shí)，菌體生長(zhǎng)旺盛，所產(chǎn)脂肪酶活力最高，而當(dāng)接種量超過0.3%時(shí)酶的活力逐漸降低，菌體大量生長(zhǎng)形成競(jìng)爭(zhēng)，不利于產(chǎn)酶。故應(yīng)選擇0.3%為最佳接種量。

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)脂肪酶的影響

在碳氮比1:4、V培養(yǎng)基:V加水量為1:1、接種量0.3%、發(fā)酵時(shí)間3d條件下，考察不同發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響，并在培養(yǎng)3d后進(jìn)行取樣測(cè)定酶活，以此考察溫度對(duì)產(chǎn)脂肪酶的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)脂肪酶的影響Fig. 2 Effect of fermentation temperature on lipase activity

由圖2可知，當(dāng)發(fā)酵溫度較低時(shí)由于菌體生長(zhǎng)緩慢導(dǎo)致產(chǎn)脂肪酶的速度慢，故酶活力較低，當(dāng)溫度為29℃時(shí)，菌體生長(zhǎng)旺盛，所產(chǎn)脂肪酶活力最高，而當(dāng)溫度超過29℃時(shí)酶的活力逐漸降低，故應(yīng)選擇29℃為最佳培養(yǎng)溫度。

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)脂肪酶的影響

在碳氮比1:4、V培養(yǎng)基:V加水量1:1、接種量0.3%、發(fā)酵溫度29℃條件下，考察不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響，并在培養(yǎng)過程中定時(shí)進(jìn)行取樣測(cè)定酶活力，以此考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)脂肪酶的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)脂肪酶的影響Fig. 3 Effect of fermentation time on lipase activity

由圖3可知，發(fā)酵初期脂肪酶活力逐漸上升，培養(yǎng)到第3天時(shí)，產(chǎn)脂肪酶量最大，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，脂肪酶產(chǎn)量在減小，酶活也在逐漸降低，故應(yīng)選擇3d為最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，培養(yǎng)基中碳氮比對(duì)酶活力的影響明顯，因此不作為本試驗(yàn)正交試驗(yàn)變量，因此選擇影響產(chǎn)酶因素含水量、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間作為正交因素。選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，以得到最有利于產(chǎn)脂肪酶的固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design arrangement and results

由表3可知，對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶酶活力影響的因素主次順序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間＞V培養(yǎng)基:V加水量。最佳組合為A2B2C2D2，即接種量0.3%、V培養(yǎng)基:V加水量為1:1、發(fā)酵溫度29℃、發(fā)酵時(shí)間3d。按照正交試驗(yàn)得出的最佳參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，此時(shí)，固態(tài)培養(yǎng)基中脂肪酶的活力最高，可達(dá)1450U/g。

2.3 自制脂肪酶應(yīng)用于合成共軛亞油酸甘油酯

在無溶劑體系中，用上述優(yōu)化結(jié)果所產(chǎn)脂肪酶代替脂肪酶Novozym 435催化CLA和花生油反應(yīng)合成CLA-SL。以CLA總接入率為指標(biāo)，在底物CLA與花生油物質(zhì)的量比為3.5:1，體系水分添加量1.5%、酶用量3%、反應(yīng)溫度60℃、反應(yīng)時(shí)間32.5h的條件下合成共軛亞油酸甘油酯[16]。在此參數(shù)下進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示CLA接入率可達(dá)到13.6%(圖4～6)。

圖4 CLA標(biāo)準(zhǔn)品的GC圖Fig.4 GC analysis of CLA standard

圖5 原料花生油的GC圖Fig.5 GC analysis of raw peanut oil

圖6 富含CLA的花生油的GC圖Fig.6 GC analysis of peanut oil rich in CLA

3 討 論

采用從大慶日月星油廠附近的土壤中篩選得到產(chǎn)脂肪酶的菌株χjA(初步鑒定為米曲霉)，在固態(tài)發(fā)酵的條件下生產(chǎn)脂肪酶，并將所產(chǎn)脂肪酶應(yīng)用于合成共軛亞油酸甘油酯。利用單因素和正交試驗(yàn)方法確定了產(chǎn)脂肪酶的最佳固態(tài)發(fā)酵條件：在種齡36h的情況下，麩皮和豆粕的質(zhì)量比1:4、培養(yǎng)基與加水量體積比1:1、接種量0.3%、發(fā)酵溫度29℃、發(fā)酵時(shí)間3d。此時(shí)，固態(tài)培養(yǎng)基中脂肪酶的活力最高，可達(dá)1450U/g。在最優(yōu)發(fā)酵條件下制得反應(yīng)產(chǎn)物共軛亞油酸甘油酯中CLA接入率可達(dá)到13.6%。自制脂肪酶比脂肪酶Novozym 435的催化結(jié)果要低，由于本實(shí)驗(yàn)所用酶酶活力不及脂肪酶Novozym 435，但篩選的脂肪酶菌株可作為今后生產(chǎn)和工業(yè)化生產(chǎn)上的出發(fā)菌株，為脂肪酶基因的克隆、工程菌的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)，進(jìn)一步應(yīng)用于合成共軛亞油酸甘油酯也有一定的工業(yè)化意義。

對(duì)米曲霉的報(bào)道中大多數(shù)是關(guān)于其產(chǎn)蛋白酶的研究，米曲霉產(chǎn)脂肪酶的報(bào)道較少，王小花等[17]對(duì)米曲霉產(chǎn)脂肪酶進(jìn)行了研究，確定了米曲霉產(chǎn)脂肪酶的最適培養(yǎng)條件，并將本結(jié)果與之進(jìn)行比較，篩選出最佳的碳源為麥芽糖與以前有關(guān)米曲霉培養(yǎng)條件的研究結(jié)果有所不同。而鄧琳芬等[18]對(duì)米曲霉產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)影響米曲霉產(chǎn)脂肪酶多種因素的優(yōu)化研究。而本實(shí)驗(yàn)是在此基礎(chǔ)上對(duì)培養(yǎng)條件上進(jìn)一步創(chuàng)新，選擇固態(tài)發(fā)酵的方法生產(chǎn)脂肪酶，并對(duì)固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化研究，以確定米曲霉產(chǎn)脂肪酶的最佳固態(tài)發(fā)酵條件。

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Screening and Application of a Lipase-Producing Strain

LIU Jing，SHI Min，XU Su，YU Dian-yu，JIANG Lian-zhou，REN Yun-hong*
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

In this study, a lipase-producing strain, named as χjA, was isolated from soil near Riyuexing oil factory in Daqing. The solid-state fermentation conditions for lipase production by the strain were optimized using one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. Meanwhile, the prepared lipase was used to synthesize conjugated linoleic acid glyceride. The results indicated that the optimal fermentation conditions were wheat bran/soybean meal mass ratio of 1:4, culture medium/adding water volume ratio of 1:1, fermentation temperature of 29 ℃, inoculation amount of 0.3%, and fermentation time of 3 days. Under these conditions, the activity of lipase was up to 1450 U/g. The load rate of conjugated linoleic acid (CLA) in the conjugated linoleic acid glyceride synthesized using the obtained lipase was 13.6%.

lipase；solid-state fermentation；lipase activity；conjugated linoleic acid glyceride

Q814.9

A

1002-6630(2012)11-0126-05

2011-10-11

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2010AA101503)

劉晶(1986—)，女，碩士研究生，研究方向糧油加工。E-mail：Liujing860530@sina.com

*通信作者：任運(yùn)宏(1959—)，男，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，本科，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：yhren4321@163.com