李丹平，朱 樂，余卓爾，潘思軼,*

(1.華中農業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.湖北省食品藥品監(jiān)督管理局，湖北 武漢 430071)

紅黑二丸中甾醇類物質的抑菌活性

李丹平1,2，朱 樂1，余卓爾1，潘思軼1,*

(1.華中農業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.湖北省食品藥品監(jiān)督管理局，湖北 武漢 430071)

采用牛津杯法和菌餅法分別測定紅黑二丸甾醇類物質對細菌和霉菌的抑菌活性，并測定其最低抑菌濃度(MIC)。結果表明：紅黑二丸甾醇類物質對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、黑曲霉和橘青霉均有一定的抑制效果，當甾醇質量濃度為7.0mg/mL時，對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，其抑菌直徑大于9mm。紅黑二丸甾醇類物質對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，其MIC值為0.5mg/mL。不同質量濃度紅黑二丸甾醇類物質對細菌的藥效持久性隨著時間的延長呈下降趨勢，且質量濃度越高，抑菌作用越明顯。

紅黑二丸；甾醇；抑菌活性

紅黑二丸，是中華秋海棠植物的根莖。中華秋海棠，為秋海棠屬(Begonia L.)多種植物的統(tǒng)稱，為多年生常綠草本花木，是著名的、經濟價值較大的觀賞花卉植物，也是同時具有藥用、食用及飼用價值的民族植物[1]。有關中華秋海棠的生藥學研究尚未見報道。目前有關秋海棠的研究主要集中在中國秋海棠屬的系統(tǒng)分類學、地理分布、分子生物學及化學成分與生物功能活性等方面。

國內外研究學者已經從秋海棠屬植物中分離并鑒定出多種化學成分，主要包括：強心苷、鞣質、皂苷、黃酮類、三萜類成分、酸性成分、甾醇等。張嘉岷等[2]曾從秋海棠(B. evansiana)中首次得到6種化合物，鑒定為豆甾醇、胡蘿卜苷、豆甾醇-3-β-D-吡喃葡萄糖苷、β-谷甾醇、4,,5,7-三羥基酮-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和β-香樹素。

植物甾醇類物質是一類廣泛存在于植物中的天然活性物質，是構成植物體內細胞膜的主要成分之一，還是多種激素、VD及甾族化合物的前體物質。近幾十年來，歐美和日本等發(fā)達國家對植物甾醇的醫(yī)藥理論和技術進行了研究，獲得了突破性進展，由全球精制混合植物甾醇的年產量已超過千余噸，可以看出植物甾醇的開發(fā)已經進入了一個全新的鼎盛時代。研究表明，β-谷甾醇的抗炎作用類似于氫化可的松和羥基保泰松，不受腦垂體腎上腺系統(tǒng)制約，且無可的松類藥物的副作用。谷甾醇還具有類似阿司匹林(乙酰水楊酸)的退熱作用。一般臨床應用的抗炎藥物多具有致潰瘍性，而谷甾醇服用量高至300mg/kg也不會引起潰瘍[3]，因而已經被人們作為輔助抗炎癥藥物而廣泛使用。仇農學等[4]采用K-B紙片法研究甾醇純化物的抑菌活性及pH值、溫度等對抑菌性的影響，并且測定其最小抑菌質量濃度(MIC)。有關甾醇類物質的抑菌作用研究較少，從已報道的研究可以看出，植物甾醇類物質對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌等細菌均具有較強的抑制作用，且不同植物來源的甾醇類物質對微生物的抑制作用不一樣，如文冠果油中植物甾醇類物質對大腸桿菌的抑制作用最為突出，但蘋果籽油中的甾醇類物質對金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌具有較強的抑制作用[4-6]。

本實驗研究紅黑二丸中甾醇類物質對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉和橘青霉等微生物的抑菌活性，并測定其MIC，為探討甾醇類物質抑菌活性機制及其在抑菌領域的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅黑二丸(Rhizome et Herba Begoniae sinensis)采自湖北恩施，洗凈晾干，粉碎后過6 0目篩備用。

甾醇標準品(含甾醇80%左右) 西安藍天生物有限公司；乙酸乙酯、濃硫酸、乙酸酐、正己烷、蔗糖、丙酮 國藥集團化學試劑有限公司；甲醇 北京迪馬科技有限公司；瓊脂粉、營養(yǎng)瓊脂、蛋白胨 北京奧博星生物技術有限責任公司；牛肉膏 北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。

1.2 供試菌種

所選菌種金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella spp.)、志賀氏菌(Shigella spp.)、熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉(Aspergillus niger)、橘青霉(Penicillium digitatum)均由華中農業(yè)大學食品科學技術學院微生物實驗室提供。

1.3 培養(yǎng)基

細菌采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3g、瓊脂20g、蛋白胨10g、NaCl 6g，蒸餾水溶解至1000mL，將其pH值調至7.0左右。

霉菌采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)：去皮馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL。

1.4 儀器與設備

JA12002紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)真空泵 上海亞榮生化儀器廠；KQ2200DB數控超聲波清洗器 昆山超聲波有限公司；Waters高效液相色譜儀 美國沃特斯公司；JA12002精密電子天平 上海天平儀器廠；DHG-9123A鼓風干燥箱上海精宏實驗設備有限公司；QE-100屹立二兩裝高速中藥粉碎機 武義縣屹立工具有限公司；HermoSavant真空冷凍干燥機 德國Alpha公司；Anke TDL-5-A型離心機 上海安亭科學儀器廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；手提式高壓滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；雙人單面凈化工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；WH-2微型漩渦混合器 上海滬西分析儀器廠有限公司；SHA-BA雙功能水浴恒溫振蕩器 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.5 方法

1.5.1 紅黑二丸甾醇類物質的提取方法[8]

提取工藝為：經過處理的紅黑二丸→乙酸乙酯→一定時間的超聲波處理→抽濾→取上清液→濃縮→甾醇提取物

提取條件為：料液比1:24(m/V)、提取溫度55℃、提取時間52min。

1.5.2 細菌抑菌活性測定

采用牛津杯法測定紅黑二丸甾醇類物質對細菌的抑制活性[7]。將供試菌種活化培養(yǎng)(37℃培養(yǎng)24h)，用無菌水稀釋，使菌懸液濃度達到106CFU/mL備用。將已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基加熱到完全融化，倒在培養(yǎng)皿內，每碟10mL(下層)，待其凝固。此外，將融化的培養(yǎng)基冷卻到50℃左右混入實驗菌(接入量0.2%)，將混有菌的培養(yǎng)基5mL加到已凝固的培養(yǎng)基上待凝固(上層)。用鑷子將無菌的牛津杯(直徑7.8mm)輕輕放入培養(yǎng)皿中，在水平放置的平皿中均勻地放置3只牛津杯。吸取不同質量濃度的甾醇類物質溶液加入牛津杯中，防止樣品溶液溢出牛津杯外，以乙酸乙酯做對照，實驗重復3次。將加入甾醇溶液的平皿放置4℃冰箱擴散4h，37℃條件下培養(yǎng)24h，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.5.3 霉菌抑菌活性測定

根據霉菌生長的特點，采用生長速率法測定紅黑二丸甾醇類物質對霉菌的抑制活性[9]。將供試菌種活化培養(yǎng)(霉菌28℃培養(yǎng)48h)，用無菌水稀釋，使孢子懸液濃度達到107CFU/mL備用。取15mL PDA培養(yǎng)基制成平板，將1mL孢子懸液加入凝固的PDA平板表面，涂勻，于28℃培養(yǎng)44h得菌體生長均勻的平板。無菌條件下，分別取各質量濃度梯度的甾醇類物質溶液1mL，注入盛有14mL融化了的培養(yǎng)基的平皿中，混勻，冷凝制成帶毒平板培養(yǎng)基(以乙酸乙酯為對照)。然后用滅菌的打孔器(直徑5mm)分別在生長均勻的菌落平板上打下菌餅，將3個菌餅的帶菌面均勻貼在帶毒平板培養(yǎng)基中央，做3次重復。置于恒溫培養(yǎng)箱中，28℃培養(yǎng)48h，用十字交叉法測量菌落的生長直徑，用下述公式計算抑菌率。

1.5.4 MIC的測定

用瓊脂稀釋法將提取的甾醇類物質溶液稀釋至2.0～70mg/mL 6個質量濃度梯度，準確量取2mL加入滅菌的培養(yǎng)皿中，并加入18mL融化的培養(yǎng)基，混勻，使其最終質量濃度分別為0.4、0.8、1.6、3.5、7.0mg/mL。等培養(yǎng)基冷卻后，劃線涂上供試菌液，每個實驗重復3次。觀察菌體的生長情況，從無菌生長的培養(yǎng)皿中找到最低藥物質量濃度的培養(yǎng)皿，此皿的藥物質量濃度即為其MIC值。

1.5.5 樣品藥效持久性測定

抑菌活性測定方法同上，于24～96h期間測量菌落直徑，衡量紅黑二丸甾醇類物質對受試菌種的藥效持久性。

2 結果與分析

2.1 紅黑二丸甾醇類物質對細菌的抑制效果

表1 不同質量濃度甾醇類物質對細菌的抑制效果Table 1 Antibacterial activity of sterol extracts from Begonia sinensis rhizome mm

由表1可知，紅黑二丸甾醇類物質對供試的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌及志賀氏菌5種細菌均有一定的抑制效果，且都隨著甾醇質量濃度的提高，抑菌作用越明顯，當甾醇質量濃度為7.0mg/mL時，對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，其抑菌直徑大于9mm。紅黑二丸甾醇類物質對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性細菌的抑制效果相差不大。

2.2 紅黑二丸甾醇類物質對霉菌的抑制效果

表2 不同質量濃度甾醇類物質對霉菌的抑菌率Table 2 Antimold activity of sterol extracts from Begonia sinensis rhizome %

由表2可知，紅黑二丸甾醇類物質對霉菌具有一定的抑制效果，且隨著甾醇類物質質量濃度的升高抑菌作用增強，且對黑曲霉和橘青霉抑制效果相當。當甾醇質量濃度達到3.5mg/mL時，其對黑曲霉和橘青霉的抑制率均達10%以上。

2.3 紅黑二丸甾醇類物質對微生物的 MIC測定

表3 甾醇類物質的MIC測定結果Table 3 MIC of sterol extracts from Begonia sinensis rhizome against bacteria and fungi

由表3可知，紅黑二丸甾醇類物質對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，其MIC值為0.5mg/mL。對枯草芽孢桿菌和熒光假單胞菌的抑制作用也比較強，均低于1.0mg/mL。對黑曲霉和橘青霉兩種霉菌的MIC值均較高，分別為1.8mg/mL和2.0mg/mL。

2.4 紅黑二丸甾醇類物質藥效持續(xù)時間的測定

2.4.1 不同質量濃度紅黑二丸甾醇類物質對細菌的藥效持久性

圖1 不同質量濃度甾醇類物質對金黃色葡萄球菌(A)、枯草芽孢桿菌(B)、大腸桿菌(C)、沙門氏菌(D)及志賀氏菌(E)的藥效持續(xù)時間的測定Fig.1 Effect of culture time on inhibition activity of sterol extracts against S. aureus (A), B. subtilis (B), E. coli (C), Salmonella spp. (D) and Shigella spp. (E)

由圖1可知，甾醇類物質的抑菌作用隨著時間的延長呈下降趨勢，且質量濃度越高，抑菌作用越明顯，但對這5種細菌的藥效持續(xù)性相差不大。經過27h后，質量濃度為7.0mg/mL的甾醇類物質對金黃色葡萄球菌的抑制效果仍較明顯，藥效降低14%左右；低質量濃度的甾醇類物質雖然抑菌效果不明顯，但其藥效降幅較為緩慢。

2.4.2 不同質量濃度紅黑二丸甾醇類物質對霉菌的藥效持久性

圖2 不同質量濃度甾醇對黑曲霉(A)和橘青霉(B)的藥效持續(xù)時間的測定Fig.2 Effect of culture time on inhibition activity of sterol extracts against A.niger (A) and P.digitatum (B)

由圖2可知，紅黑二丸甾醇類物質對霉菌抑制效果的藥效持續(xù)性與質量濃度密切相關，高質量濃度時其藥效持續(xù)性較好，隨著質量濃度的降低，其抑制效果降低程度逐漸顯著。對黑曲霉和橘青霉兩種霉菌的藥效持久性總體趨勢相近，相差不明顯。

3 結 論

本實驗采用牛津杯法測定了紅黑二丸甾醇提取物對細菌的抑菌活性，采用菌餅法測定了紅黑二丸甾醇類物質對霉菌的抑制效果，并使用瓊脂稀釋法確定了紅黑二丸甾醇類物質對各微生物的MIC。實驗結果表明：1)紅黑二丸甾醇類物質對供試的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌及志賀氏菌均有一定的抑制效果，且都隨著甾醇類物質質量濃度的提高，抑菌作用越明顯，當甾醇類物質質量濃度為7.0mg/mL時，對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，其抑菌直徑大于9mm。紅黑二丸甾醇類物質對霉菌具有一定的抑制效果，且隨著甾醇類物質質量濃度的升高抑菌作用增強，且對黑曲霉和橘青霉抑制效果相當。紅黑二丸甾醇類物質對微生物的MIC測定結果顯示紅黑二丸甾醇類物質對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，其MIC值為0.5mg/mL，但對黑曲霉和橘青霉兩種霉菌的MIC值均較高。2)不同質量濃度紅黑二丸甾醇類物質對細菌的藥效持久性隨著時間的延長呈下降趨勢，且濃度越高，抑菌作用越明顯，但對這7種細菌和兩種霉菌的藥效持續(xù)性相差不大。

國內對植物甾醇抑菌特性的研究較少，陳曉蘭等[10]研究了一些藥用植物對5種植物病原真菌的抗菌活性，結果發(fā)現一點血Begonia wilsonii(紅黑二丸科)甲醇類物質對荔枝霜疫霉病菌Peronophythora litchii的抑菌率為100%。楊利[11]對麥角甾醇生物合成的8個新三唑類化合物的抑菌活性進行了測定，結果表明，在質量濃度100mg/L條件下，所合成的8個化合物對這4種植物病原真菌的菌絲生長均有不同程度的抑制作用。仇農學等[4]采用采用K-B紙片法研究甾醇純化物的菌制活性及pH值、溫度等對抑菌性的影響，并且測定其MIC，結果顯示，甾醇對金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌具有很好的抑制作用，MIC分別為18μg/mL和30μg/mL，對大腸桿菌及蠟樣芽孢桿菌有抑制作用，對黑曲霉沒有抑制作用；在pH 5～6條件下其抑菌效果最佳；一定溫度內熱處理不影響蘋果籽油中甾醇的抑菌活性，進而得出結論蘋果籽油中植物甾醇有廣譜和常溫的抑菌活性。

相對于其研究結果，本實驗所得紅黑二丸中的甾醇類物質對細菌和霉菌的抑菌質量濃度均較高，達到0.5～2.0mg/mL之間，且對霉菌也有一定抑制效果。類似的實驗結果在徐雅琴等[5]的研究中也被發(fā)現，他們發(fā)現南瓜籽植物甾醇對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌均有很好的抑制作用，當質量濃度達到3.0mg/mL時可以完全抑制供試菌的生長。但曹立強等[6]研究發(fā)現文冠果油中植物甾醇粗提物對毛霉和青霉無抑制作用，對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有明顯抑制作用，且對大腸桿菌的抑制作用尤為突出。植物甾醇種類較多，不同結構的甾醇類物質對微生物的抑制作用不盡相同。

紅黑二丸甾醇類物質對微生物的抑制作用存在明顯的量效關系，隨著質量濃度的降低，抑菌效果在逐漸降低。MIC結果顯示紅黑二丸甾醇類物質對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌的抑制作用相差不大。在抑制霉菌方面，紅黑二丸甾醇類物質對黑曲霉和橘青霉有一定的抑制效果，且對兩種霉菌的MIC值均較大。

影響抑菌圈大小的因素很多，如抑菌成分的質量濃度及處理方式、接種的菌液濃度、抑菌成分的溶解性和擴散速度、微生物的生長速度等[12]。此外，同種植物品種由于產區(qū)、采收季節(jié)、成熟度、使用部位等的不同，也會影響其有效抑菌成分的含量[13]。

[1]范文娟, 高昂, 鞏江, 等. 全球紅黑二丸屬藥學研究概況[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學學報, 2011(2): 59-61.

[2]張嘉岷, 陳耀祖, 李伯剛, 等. 紅黑二丸化學成分的研究[J]. 中國中藥雜志, 1997, 22(5): 295.

[3]裘愛泳, 吳時敏. 脫臭餾出物中植物甾醇的回收[J]. 中國油脂, 1997, 22(3): 49-50.

[4]仇農學, 劉海霞, 趙雁武, 等. 蘋果籽油中甾醇物質的分離純化及抑菌活性研究[J]. 食品科學, 2009, 30(8): 51-55.

[5]徐雅琴, 龐麗萍, 齊會娟, 等. 南瓜籽植物甾醇的抗氧化性及抑菌性研究[J]. 農產品加工: 學刊, 2012(4): 27-30.

[6]曹立強, 李丹丹, 鄧紅, 等. 文冠果油中植物甾醇的提取及其抑菌特性研究[J]. 天然產物研究與開發(fā), 2010, 22(2): 334-338.

[7]劉冬梅, 李理, 楊曉泉, 等. 用牛津杯法測定益生菌的抑菌活力[J].食品研究與開發(fā), 2006(3): 110-111.

[8]高麗. 中華秋海棠幽醇類化合物的提取、純化及微膠囊化研究[D].武漢: 華中農業(yè)大學, 2010.

[9]陳利軍, 尹健, 熊建偉, 等. 7種藥用植物提取物抑菌活性測定[J]. 安徽農業(yè)科學, 2006, 34(21): 5562-5571.

[10]陳曉蘭, 王忠文, 潘汝謙, 等. 一些藥用植物對5種植物病原真菌的抗菌活性[J]. 華中農業(yè)大學學報, 2008, 27(6): 718-722.

[11]楊利. 麥角甾醇生物合成抑制劑的合成及及抑菌活性研究[D]. 楊凌:西北農林科技大學, 2008.

[12]耿曉玲. 楊梅果實提取物的抑菌作用研究[D]. 無錫: 江南大學, 2007.

[13]JULIANO C, MATTANA A, USAI M. Composition and in vitro antimicrobial activity of the essential oils of Thymus herba-barona Loisel growing wild in Sardinia[J]. Journal of Essential Oil Research, 2000, 12: 516-522.

Antimicrobial Activity of Sterol Extracts from Begonia sinensis Rhizome

LI Dan-ping1,2， ZHU Le1，YU Zhuo-er1，PAN Si-yi1,*
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China；2. Food and Drug Administration of Hubei Province, Wuhan 430071, China)

In this study, the inhibitory activity against bacteria and fungi of sterol extracts from Begonia sinensis rhizome was investigated by Oxford cup assay and growth rate assay, respectively. The results showed that sterol extracts had strong inhibition on Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., Aspergillus niger and Penicillium digitatum. Among these microorganisms, sterol extracts showed the strongest inhibition against Staphylococcus aureus with an inhibition diameters larger than 9 mm and an MIC of 0.5 mg/mL. It was also found that the inhibition of microorganism by sterol extracts was positivley correlated with their concentration but negatively correlated with culture time.

Begonia sinensis rhizome；sterol；antimicrobial activity

Q548

A

1002-6630(2012)11-0070-05

2012-04-26

國家民委科研基金資助項目(05ZN11)

李丹平(1959—)，男，副主任藥師，博士研究生，研究方向為中藥資源與質量。E-mail：lidanping1918@126.com

*通信作者：潘思軼(1964—)，男，教授，博士，研究方向為農產品加工化學。E-mail：pansiyi@mail.hzau.edu.cn