鄭國(guó)灣，董勝?gòu)?，俞曉?/p>

（中國(guó)計(jì)量學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江省生物計(jì)量與檢驗(yàn)檢疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018）

肌動(dòng)蛋白（actin）是一種廣泛存在于真核生物細(xì)胞中的多功能球狀蛋白，由單個(gè)亞基構(gòu)成，主要分為：參與細(xì)胞骨架組成的微絲，參與肌肉細(xì)胞的收縮的肌細(xì)絲［1，2］.肌動(dòng)蛋白是一類高度保守的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列在各個(gè)物種間的差異不超過20%，是細(xì)胞內(nèi)的管家基因.肌動(dòng)蛋白參與許多重要的細(xì)胞生理過程，包括肌肉收縮，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞分裂，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞連接建立和細(xì)胞形態(tài)維持等［1，3］.作為細(xì)胞內(nèi)的管家基因，肌動(dòng)蛋白在生物體內(nèi)的生理或者受刺激狀態(tài)下都保持持續(xù)恒量表達(dá)，因此在許多量化實(shí)驗(yàn)中，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR，半定量RTPCR，Western blot和Northern blot雜交中均作為內(nèi)參基因［4］.

福壽螺Pomacea canaliculata（Lamarck），又名蘋果螺、大瓶螺，是一種大型的淡水螺類，隸屬于軟體動(dòng)物門（Mollusca）、腹足綱（Gastropoda）、新進(jìn)腹足目（Caenogastropoda）的瓶螺科（Ampullariidae）.福壽螺原產(chǎn)于南美洲亞馬遜流域，因其被高估的經(jīng)濟(jì)價(jià)值在20世紀(jì)80年代相繼被亞洲許多國(guó)家引進(jìn)并飼養(yǎng)［5］.福壽螺適應(yīng)能力強(qiáng)，繁殖快，食性雜，在食物充足并缺乏有效天敵的環(huán)境中能迅速建立起種群，并成為當(dāng)?shù)厣锶郝涞膬?yōu)勢(shì)種［6，7］.福壽螺喜食水稻幼苗及其它水生作物，現(xiàn)已成為我國(guó)及其他亞洲國(guó)家嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)有害生物之一［7，8］.

然而迄今為止，有關(guān)福壽螺β－actin基因的研究尚未見報(bào)道.本研究成功地克隆了入侵我國(guó)的福壽螺β－actin片段cDNA，并分析了其序列組成.通過檢測(cè)其在鰓、消化腺、腎和足部肌肉組織等中的表達(dá)情況，為以后研究福壽螺其它功能基因提供了分子內(nèi)標(biāo).此外，分析福壽螺β－actin基因片段序列與其他物種序列的差異性，并采用NJ法同其它相近物種構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，初步探討福壽螺與其它物種的親緣關(guān)系，為福壽螺的入侵和危害提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 樣品采集和處理

成年福壽螺采自浙江余姚茭白田間.所有福壽螺個(gè)體在恒溫實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行缸養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為（26±1）℃，光照D∶L＝12h∶12h，喂養(yǎng)食料為新鮮白菜葉.在實(shí)驗(yàn)前，所有采集的福壽螺進(jìn)行至少10d以上的馴養(yǎng).挑取健康福壽螺，進(jìn)行24h饑餓處理后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn).

1.2 主要試劑

Trizol?reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit，LA－Taq DNA 聚合酶，r－Taq DNA 聚合酶，DL2000DNA Marker，pMD－18Tvector購(gòu) 自TaKaRa公司；Gel Extraction kit購(gòu)自Axygen公司；其它試劑均為分析純，所用水均為超純水.

1.3 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

取福壽螺鰓、消化腺、腎和足部肌肉鮮活組織，按照Trizol試劑操作說明書抽提總RNA，電泳檢測(cè)其完整性，通過核酸定量?jī)x檢測(cè)其濃度和純度，以保證其OD260／OD280在1.8到2.0的范圍內(nèi).按照反轉(zhuǎn)錄PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書合成第一鏈cDNA.

1.4 福壽螺β－actin cDNA片段序列的獲得

根據(jù)GenBank中的相近種光滑雙臍螺Biomphalaria glabrata（登錄號(hào)：U53348），盤鮑螺Haliotis discus（登錄號(hào)：EF103363），文蛤 Meretrix meretrix（登 錄 號(hào)：JN084197），櫛 孔 扇 貝Chlamys farreri（登錄號(hào)：AY335441），紫貽貝Mytilus galloprovincialis（登錄號(hào)：AF157491）的β－actin cDNA序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物actin－F和actin－R，用于來擴(kuò)增β－actin的cDNA 片段.PCR 反應(yīng)體系為：5μl 10×PCR Buffer（Mg2＋Plus），4 μl dNTP Mixture （each 2.5mM），2μl模板cDNA正反引物（10μM）各1μl，TaKaRa Taq（5U／μl）0.25μl，加ddH2O至50μl.擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；然后94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min.所得的PCR產(chǎn)物均用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收后，連接到pMD－18T，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH－5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取的陽性克隆送至上海博尚生物有限公司測(cè)序.

1.5 序列分析和數(shù)據(jù)處理

通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的BLAST功能，鑒定獲得的β－actin cDNA全長(zhǎng)是否屬于相應(yīng)的actin基因家族.使用DNAMAN軟件，將根據(jù)β－actin cDNA推測(cè)出的編碼框氨基酸序列同其它部分已知物種相應(yīng)的β－actin氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并且使用 MEGA 5.0（Neighbor－Joining）構(gòu)建了相應(yīng)的生物系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用Bootstrap（重復(fù)數(shù)1000）檢驗(yàn)分子系統(tǒng)樹各分支的置信度.

1.6 福壽螺β－actin基因在4個(gè)組織中的轉(zhuǎn)錄水平

根據(jù)獲得的β－actin基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物actin－F和actin－R：5′－TCACCAT TGGCAACGAGAGAT－3′和5′－TCTCGTGA ATACCAGCCGACT－3′，對(duì)福壽螺鰓組織cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)退火溫度及循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得適宜的實(shí)驗(yàn)參數(shù).采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系對(duì)福壽螺鰓、消化腺、腎和足部肌肉組織的RNA進(jìn)行半定量PCR檢測(cè).PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；然后94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共28個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè).

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征分析

經(jīng)RT－PCR擴(kuò)增，電泳后獲得福壽螺β－actin基因片段清晰單一的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1）.序列測(cè)定表明福壽螺β－actin基因序列長(zhǎng)度為840bp，與電泳圖預(yù)測(cè)大小一致.其推導(dǎo)的氨基酸序列（280個(gè)）均為β－actin基因開放閱讀框的一部分（圖2）.

圖1 福壽螺β－actin擴(kuò)增電泳圖譜Figure 1 PCR amplification ofβ－actin in apple snail

圖2 福壽螺β－actin基因片段核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列Figure 2 Nucleotide and deduced amino acid sequences ofβ－actin cDNA fragment

福壽螺β－actin基因片段推導(dǎo)的氨基酸序列在NCBI中經(jīng)過BLAST搜索，與其他已知物種β－actin基因進(jìn)行同源性比較.發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與其他已知相近物種基因的部分片段或全長(zhǎng)具有高度同源性94%～98%（表1），且與軟體動(dòng)物間具有更高的同源性.

表1 福壽螺β－actin基因推導(dǎo)的片段氨基酸序列同源性比較Table 1 Identity comparison of the amino acid sequences of theβ－actin cDNA fragments in apple snail

基于福壽螺β－actin推導(dǎo)氨基酸序列及表1物種的序列，采用MEGA 5.0軟件以NJ法構(gòu)建了8種動(dòng)物的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）.福壽螺與軟體動(dòng)物門的其他物種聚為一簇，然后與節(jié)肢動(dòng)物聚為一簇，再與脊椎動(dòng)物聚為一簇.

圖3 根據(jù)部分β－actin氨基酸序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 Phylogenetic tree of amino acids sequences of β－actin genes constructed with the neighborjoining method

2.2 福壽螺β－actin基因的表達(dá)分析

在優(yōu)化的PCR條件下，使用RT－PCR檢測(cè)福壽螺β－actin基因在其鰓、消化腺、腎和足部肌肉等組織的轉(zhuǎn)錄水平.電泳結(jié)果（圖4）顯示β－actin基因在這四個(gè)組織中的表達(dá)基本一致，具有良好的穩(wěn)定性，表明該基因適合作為內(nèi)參基因.

圖4 福壽螺四種組織β－actin基因的RT－PCR檢測(cè)Figure 4 Relative expression ofβ－actin mRNAs in four different tissues

3 討 論

本研究采用簡(jiǎn)并PCR成功地獲得了福壽螺β－actin基因部分cDNA序列，這是在淡水螺類中是首次報(bào)道.目前對(duì)軟體動(dòng)物β－actin基因的研究主要集中在海水貝類等經(jīng)濟(jì)軟體動(dòng)物，如太平洋牡蠣（C.giga）［9］、蝦夷扇貝（Patinopecten yessoens）［10］、皺紋盤鮑（H.discus hannai）［11］等.本次得到的福壽螺β－actin氨基酸序列不但與太平洋牡蠣、光滑雙臍螺（B.glabrata）等軟體動(dòng)物具有很高的相似性，而且與果蠅（D.melanogaster）、斑馬魚（D.rerio）、大鼠（R.norvegicus）等動(dòng)物也有較高的相似性，這符合β－actin基因氨基酸編碼區(qū)高度保守的特點(diǎn)［4，12］，可能與它參與構(gòu)成細(xì)胞骨架等重要功能密切相關(guān).

β－actin基因一直以來被作為內(nèi)參基因廣泛應(yīng)用于基因的相對(duì)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中.本實(shí)驗(yàn)從半定量PCR得到的結(jié)果表明，福壽螺β－actin基因在鰓、消化腺、腎和足部肌肉組織等組織中表達(dá)基本一致，并具有良好的穩(wěn)定性.軟體動(dòng)物分子生物學(xué)研究中，β－actin基因仍是最常用的內(nèi)參基因，如櫛孔扇貝（C.farreri）［13］、皺紋盤鮑（H.discus hannai）［14］、合浦珠母貝 （Pinctada fucata）［15］等，而且表達(dá)穩(wěn)定.因此，只要通過在福壽螺表達(dá)試驗(yàn)中β－actin基因是否受到實(shí)驗(yàn)操作的影響的研究，就可以判定該基因是否可以作為研究福壽螺其他功能基因相對(duì)表達(dá)的內(nèi)參基因.

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