楊文娟，牛 陽，王 榮，毛跟年

（1.陜西科技大學(xué)，陜西西安 710021；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏銀川 750004）

骨傷寧軟膏是寧夏吳忠回醫(yī)正骨醫(yī)院臨床用于治療骨折中后期的有效制劑，能夠改善骨折部位的生物力學(xué)性能，對(duì)骨痂內(nèi)骨膠原的積累和鈣鹽沉積有促進(jìn)作用，改善蛋白代謝，促進(jìn)蛋白質(zhì)多糖合成及鈣化，加速骨痂的形成和骨折愈合的時(shí)間。不僅保證了骨折愈合，促進(jìn)骨痂生長(zhǎng)，還能防止骨不連發(fā)生［1］。骨傷寧軟膏中含有紅花、海螵蛸、自然銅等藥材，其中紅花藥材用藥量大，具有活血散淤、消腫止痛的作用，本文采用正交實(shí)驗(yàn)法，以紫外分光光度法測(cè)定紅花提取液中羥基紅花黃色素A（HSYA）的含量，同時(shí)考慮到骨傷寧軟膏在制劑成型中對(duì)原料產(chǎn)量的要求，故將提取工藝的干膏率也作為該工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，對(duì)這兩項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，以優(yōu)選提取骨傷寧軟膏中紅花藥材的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 紅花產(chǎn)地新疆，購(gòu)于西安鹿鳴中藥飲片廠，為菊科植物紅花（CarthamustinctoriusL.）的干燥花。方中海螵蛸、自然銅等藥材經(jīng)鑒定均為正品藥材。HSYA 對(duì)照品（批號(hào)111637－200803），由中國(guó)藥品生物制品檢定所供應(yīng)。

1.1.2 儀器 754PC型紫外－可見分光光度計(jì)為上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)品，F(xiàn)A1004N電子分析天平為上海精科天平儀器廠產(chǎn)品，DHG－9123A臺(tái)式鼓風(fēng)干燥器為上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 HSYA含量測(cè)定

1.2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 分別配制HSYA對(duì)照品以及骨傷寧軟膏各藥材水提取液，在200nm～500nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以HSYA及水提取液的最大吸收波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.1.2 HSYA標(biāo)準(zhǔn)曲線確定 精密稱取HSYA對(duì)照品0.001 2g，蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，制成儲(chǔ)備液。分別量取儲(chǔ)備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL對(duì)照品溶液于10mL量瓶中，蒸餾水定容至刻度，搖勻，配制成濃度分別為2.4、4.8、7.2、9.6、12.0、14.4μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1.2.1.3 方法學(xué)考察 為了保證HSYA含量測(cè)定方法的可靠性，對(duì)該含量測(cè)定方法進(jìn)行精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、加樣回收率等方法學(xué)考察。精密度試驗(yàn)取同一份HSYA對(duì)照品溶液連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）；重現(xiàn)性試驗(yàn)取同一份水提液連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算RSD；穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份HSYA對(duì)照品溶液在15、30、45、60、75、90min測(cè)定，計(jì)算RSD；加樣回收率試驗(yàn)取已知濃度的同一水提取液6份，分別加入相當(dāng)于已知濃度60%、80%、100%的HSYA對(duì)照品溶液各2份，計(jì)算回收率。

1.2.2 水提浸膏的制備 稱量按處方比例混合的海螵蛸、自然銅等藥材1.8g，用10倍量水在常溫下浸泡30min，然后按處方量加入紅花藥材，按照表1安排的正交實(shí)驗(yàn)條件，加入一定倍量水，在一定溫度下溫浸一定時(shí)間，抽濾，濾液留用。藥渣按同樣條件處理，抽濾，合并2次濾液。取少量濾液按照1.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定HSYA含量。將合并后濾液轉(zhuǎn)移至干燥恒重蒸發(fā)皿中，于水浴蒸發(fā)至干，105℃干燥3 h，移至干燥器中，冷卻30min，迅速精密稱重，計(jì)算干膏率。以HSYA含量和干膏率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)均為0.5。

1.2.3 提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)和文獻(xiàn)報(bào)道［2－5］，選取加水倍量、提取溫度、提取時(shí)間等3個(gè)影響因素，每個(gè)因素選3個(gè)水平，按表1設(shè)計(jì)L9正交試驗(yàn)。

表1 因素水平Table 1 Factors and levels

1.2.4 提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果得到骨傷寧軟膏的水提取工藝，為了保證該工藝的重現(xiàn)性，對(duì)該工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

以蒸餾水為參比液，對(duì)HSYA對(duì)照品溶液以及水提取液在200nm～500nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到最大吸收波長(zhǎng)均在404nm處，因此，采用404nm為骨傷寧軟膏紅花藥材提取工藝中HSYA含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 HSYA標(biāo)準(zhǔn)曲線

以濃度（C）對(duì)吸光度（OD）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果表明，HSYA對(duì)照品溶液在濃度與吸光度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，經(jīng)回歸處理得方程：C＝45.56OD－0.004 2，R2＝0.999 7（圖1）。

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)測(cè)定同一HSYA對(duì)照品溶液5次，RSD為0.61%，方法精密度良好；重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)測(cè)定同一份水提液5次，RSD為0.83%；穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，每隔15min測(cè)定HSYA對(duì)照品溶液吸光度，RSD為0.86%，表明HSYA對(duì)照品溶液在90min內(nèi)穩(wěn)定性良好；加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示，6次試驗(yàn)的平均回收率為99.5%。

圖1 HSYA標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程Fig.1 Standard curve and regression equation of HSYA

2.4 提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

按照1.2.2中水提浸膏的方法及表1的因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2中極差R值可知，影響因素主次為A＞B＞C，表3的方差分析結(jié)果表明，影響因素主次為A＞B＞C，即提取溫度是影響HSYA提取率的主要因素，這與HSYA對(duì)熱不穩(wěn)定，遇熱易分解的性質(zhì)相符［6－8］，最佳提取工藝為A1B3C3。由正交試驗(yàn)的9次試驗(yàn)結(jié)果可知，方案3（A1B3C3）的綜合指標(biāo)分?jǐn)?shù)最高，這與直觀分析和方差分析后的結(jié)果一致。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2Results of orthogonal test

2.5 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)選的最佳提取工藝A1B3C3進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，試驗(yàn)重現(xiàn)性好，工藝穩(wěn)定，HSYA含量較高，且干膏率也符合骨傷寧軟膏制備所需的原料要求，故最佳提取工藝為A1B3C3，即加水15倍量，在70℃下溫浸90 min，提取2次。

表3 方差分析結(jié)果Table 3Results of variance analysis

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4Results of verifying test

3 討論

骨傷寧軟膏為回藥治療骨傷的傳統(tǒng)方，具有續(xù)破折，止血收斂，止痛，生肌的功效，臨床主治筋肉斷裂、創(chuàng)傷不愈、血流不止等病癥。骨折愈合的過程就是“淤去、新生、骨合”的過程，對(duì)“折傷”的論治，歷代醫(yī)家強(qiáng)調(diào)了活血、益氣，補(bǔ)腎幾方面，強(qiáng)調(diào)活血化淤在骨折損傷治療中的重要性［9］。方中包括紅花、自然銅、海螵蛸等具有活血化淤、祛風(fēng)利濕、止痛功效藥材。海螵蛸、自然銅等為礦石、骨甲類藥材，按照中藥煎煮原則，屬于先煎藥材，有效成分用水冷浸后再進(jìn)行熱水提取。紅花為植物的花，質(zhì)地較輕，按照中藥煎煮原則，屬于后下藥材，先冷浸一定時(shí)間再進(jìn)行提取。其中紅花藥材用量最大，HSYA為活血化瘀的主要活性成分［10－11］，在水中的穩(wěn)定性要優(yōu)于在乙醇中［12］，且對(duì)熱不穩(wěn)定，故選擇熱水溫浸法進(jìn)行提取?？紤]到對(duì)溫度敏感，因此在試驗(yàn)中設(shè)置了對(duì)提取溫度的考察，結(jié)果表明，提取溫度是影響HSYA提取的關(guān)鍵因素。此外，考慮到藥材提取物得率是影響制劑制備原料的重要因素，因此，將干膏率與HSYA含量綜合評(píng)分。由正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可知，最佳組合A1B3C3與正交試驗(yàn)方案3的組合一致。通過對(duì)該最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，工藝A1B3C3的干膏率和HSYA含量穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，工藝可操作性好。故選擇A1B3C3為骨傷寧軟膏紅花藥材提取工藝的最優(yōu)組合方案。

［1］馬英鋒，張金軍，牛 陽，等.回藥張氏正骨膏治療骨不連60例療效觀察［J］.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31（1）：125.

［2］初 陽，宋洪濤，陳大為，等.紅花黃色素提取工藝的研究［J］.中草藥，2006，37（8）：1161－1164.

［3］劉慶華，陳孝娟，于 萍，等.紅花紅色素的提取工藝研究［J］.新疆醫(yī)學(xué)，2011，41（3）：133－136.

［4］朱文明，潘 見，金日生，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選紅花中紅花黃色素提取工藝［J］.安徽大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，32（1）：85－89.

［5］于紅艷，董玉秀.紅花提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)研究［J］.河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，11（6）：35－36.

［6］孫婷婷，蔣麗芳，裴正玲，等.影響紅花紅色素穩(wěn)定性的因子研究［J］.微量元素與健康研究，2011，28（1）：38－40.

［7］王 慧，張立偉，晉民杰，等.羥基紅花黃色素A穩(wěn)定性研究［J］.太原科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31（1）：81－84.

［8］金 鳴，臧寶霞，李金榮，等.羥基紅花黃色素?zé)岱€(wěn)定性的初步研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2003，28（12）：1197－1198.

［9］張永斌，王 蕭，郭學(xué)軍，等.壯筋補(bǔ)骨丸促進(jìn)新西蘭兔骨折愈合的 X線影像學(xué)比較研究［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，28（2）：37－41.

［10］Matsuba S，Yamada N，Yamazaki T.Antioxidative activity of safflor components in rats［J］.J Japan Soci Nutri Food Sci，2003，56：365－369.

［11］Kanehim T，Homma T，Saito K.On restricting activity of cartham in and safflor yellow B against superoxid anion formation in an experimental model system［J］.Romanian Biotech Lett，2001，5（5）：361－364.

［12］李秀梅，黃羅生，富志軍.光照條件對(duì)紅花黃色素穩(wěn)定性的影響［J］.海峽藥學(xué)，2011，23（5）：64－66.