俞春紅，彭 寬，史玉婷，孫科軍，陳 韜＊

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.中南林業(yè)科技大學(xué)生物技術(shù)開放性中心實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410004）

目前細(xì)菌耐藥性已成為全球關(guān)注重點(diǎn)問(wèn)題，隨著抗生素的濫用，細(xì)菌耐藥性日趨嚴(yán)重。國(guó)內(nèi)外許多研究者通過(guò)尋找到一些新型的抗菌物質(zhì)來(lái)替代抗生素的應(yīng)用，最近幾年研究最多的是抗菌肽，已有大量的研究表明抗菌肽具有較廣的生物學(xué)活性，如具有抗真菌、病毒及原蟲的活性，廣譜的抗細(xì)菌活性，并且與傳統(tǒng)抗生素合用起到協(xié)同作用。另外，在抗腫瘤，先天性免疫及獲得免疫調(diào)節(jié)方面具有其特有的作用［1］?？咕牡姆N類繁多，其作用機(jī)制也各有不同。已從昆蟲、海洋無(wú)脊椎動(dòng)物、各種細(xì)菌分泌的細(xì)菌素、動(dòng)物腸道及生殖道等都已分離到了抗菌肽類物質(zhì)。早在1981年瑞典科學(xué)家Steiner H等從惜古比天蠶蛹中發(fā)現(xiàn)了新的抗菌類物質(zhì)并命名為殺菌肽［2］。隨后研究者們?cè)诤Ｑ鬅o(wú)脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)有甲殼動(dòng)物、貝類及海鞘類抗菌肽，在食品保鮮方面有很好的應(yīng)用前景［3］。對(duì)于細(xì)菌素研究最多的是乳酸菌細(xì)菌素，其大致分為四類蛋白或者小分子肽類［4］。Klaenhammer T R［5］認(rèn)為，99%的細(xì)菌可以產(chǎn)生至少一種細(xì)菌素。乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素能廣泛存在于乳酸菌代謝產(chǎn)物中，能抑制病原菌及食品腐敗菌［6］。肖靜等［7］從健康雞、鼠、兔的腸道及胃內(nèi)分離到6株乳酸菌，并篩選出3株能分泌具有抑菌活性物質(zhì)的乳酸菌。

由于自然水體環(huán)境的不斷惡化及抗生素的濫用，水產(chǎn)養(yǎng)殖中的致病菌的耐藥性也不斷增大，導(dǎo)致抗菌藥物失效。研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群內(nèi)90%以上是厭氧菌，并且具有對(duì)抗外來(lái)菌群及寄生蟲的作用［8］。其優(yōu)勢(shì)菌在體外也能表現(xiàn)出不同程度的抗菌效果，依魚種類不同其抗菌活力也不一致，而且還發(fā)現(xiàn)它們分泌的抗菌物質(zhì)對(duì)腸道菌群的組成也有一定的影響［9］。孫建明等［10］從草魚腸道內(nèi)分離到了具有對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和嗜產(chǎn)水氣單胞菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性的抗菌肽類物質(zhì)。黃平等［11］研究發(fā)現(xiàn)草魚腸道抗菌肽具有很好的熱穩(wěn)定性及耐胰蛋白酶的特性。本研究通過(guò)分離草魚腸道的菌群，然后分離純化得到腸道菌群分泌的細(xì)菌素，進(jìn)一步探究草魚腸道內(nèi)固有抵抗外來(lái)菌群的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物與菌株 成年健康草魚，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地提供。致病性大腸埃希菌（pathogenic Escherichia coli）湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)魚類微生物研究室提供。

1.1.2 主要試劑和儀器 乙酸銨（上海生工BBI AR）、硫酸銨，氨水，氯化鋇，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，冰醋酸（天津恒星AR）、胰蛋白胨、酵母提取物、Agar、NaCl（上海生工BBI AR）、瓊脂粉（上海生工BBI Micro－bio）、HPLC級(jí)乙腈，HPLC級(jí)三氟乙酸（日本島津）、Sephadex LH20（Phamacia）。

1.1.3 主要儀器 超聲波破碎儀（美國(guó)必能信Branson S－450D），冷凍真空干燥機(jī)（美國(guó)熱電Thermo Scientific Modulyo－D230 ＆SPD111V），臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)熱電 Thermo Scientific Sorvall Legend Mach 1.6 R），高效液相色譜儀（日本島津Shimadzu LC－20A）。

1.2 方法

1.2.1 草魚腸道微生物培養(yǎng)條件的選擇

1.2.1.1 草魚腸道微生物L(fēng)B液體培養(yǎng)基厭氧及有氧培養(yǎng) 采取新鮮草魚腸道，去掉脂肪后解剖腸道，無(wú)菌收集腸道黏膜附著物。分別取100μL內(nèi)容物于10 mL的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，進(jìn)行有氧和厭氧培養(yǎng)（用抽氣換氣法制造厭氧環(huán)境）。37℃培養(yǎng)24 h之后，將有氧及厭氧培養(yǎng)的培養(yǎng)液經(jīng)4 500 r／min離心10 min，收集上清并用冷凍離心機(jī)離心凍干。然后分別用400μL無(wú)菌水溶解凍干樣品。將溶解所得的樣品分別用0.22μm孔徑的微孔濾膜過(guò)濾除菌，即獲得無(wú)菌的有氧及厭氧培養(yǎng)液濃縮樣品。

挑取E.coli單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基中，200 r／min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600 nm＝0.8，取100 μL菌液均勻涂于LB固體培養(yǎng)基平板上，然后用濾紙片法檢測(cè)濃縮樣品對(duì)E.coli的抑菌活性。將等比例濃縮的培養(yǎng)基及無(wú)菌水做為對(duì)照，每張紙片加20μL溶液。37℃培養(yǎng)過(guò)夜，隔日觀察結(jié)果。

1.2.1.2 草魚腸道厭氧菌分離培養(yǎng) 采用劃線法將腸道內(nèi)容物的菌液接種于LB固體培養(yǎng)基平板。37℃厭氧培養(yǎng)過(guò)夜，次日觀察單個(gè)菌落的形態(tài)，并挑取不同形態(tài)的單個(gè)菌落于LB液體培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)24 h。然后將各單個(gè)菌落培養(yǎng)液濃縮并過(guò)濾除菌，濾紙片法檢測(cè)其對(duì)E.coli抑菌活性。

1.2.2 草魚腸道微生物擴(kuò)大培養(yǎng)及其細(xì)菌素的分離純化

1.2.2.1 乙醇分級(jí)沉淀法初步分離純化擴(kuò)大培養(yǎng)物 將收集的腸道內(nèi)容物用M9培養(yǎng)基厭氧擴(kuò)大培養(yǎng)，并獲得較多的培養(yǎng)液濃縮樣品。用少量的無(wú)菌水溶解凍干樣品，然后用乙醇分級(jí)沉淀法進(jìn)行初步分離樣品，其中樣品：無(wú)水乙醇的比例分別為1∶2，2∶3，3∶4，4∶5，在－20℃靜置30 min后13 000 r／min離心10 min。將沉淀保存，收集上清并使乙醇濃度從1／2增加到2／3，2／3到3／4，3／4到4／5，－20℃靜置過(guò)夜，次日13 000 r／min離心10 min。沉淀保存，收集上清于冷凍離心機(jī)凍干。濾紙片法檢測(cè)各沉淀和上清對(duì)E.coli的抑菌活性。

1.2.2.2 乙醇分離所得抑菌活性成分的凝膠過(guò)濾層析 收集500 mL／L～900 mL／L乙醇之間的沉淀冷凍干燥除去乙醇，無(wú)菌水溶解并經(jīng)12 000 r／min離心10 min。所得上清以凝膠過(guò)濾方法（分子篩柱為日本東曹達(dá)TSK－2500PW）分離，流動(dòng)相為1.0 g／L TFA dd H2O，0.4 mL／min流速洗脫，280 nm紫外吸收檢測(cè)，按峰收集。將每管樣品經(jīng)冷凍離心機(jī)凍干后用濾紙片法檢測(cè)各洗脫組分對(duì)E.coli的抗菌活性。

1.2.2.3 RP－HPLC純化 使用C－18分析型色譜柱（Thermo HYPERSIL GOLD 3μm 150×4.6 mm），日本島津高效液相色譜儀（Shimadazu Prominence LC－20A）對(duì)具有抑菌活性的2號(hào)和3號(hào)峰樣品進(jìn)一步分離純化。色譜條件：20 min內(nèi)乙腈濃度由50 mL／L升至850 mL／L，流速0.8 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，按峰收集，各組分經(jīng)冷凍離心機(jī)凍干后，紙片法檢測(cè)各個(gè)吸收峰對(duì)E.coli的抗菌活性。

2 結(jié)果

2.1 草魚腸道微生物不同條件培養(yǎng)物的抑菌活性檢測(cè)

通過(guò)濾紙片法檢測(cè)體外草魚腸道菌群有氧及厭氧培養(yǎng)物對(duì)E.coli的抑菌活性。結(jié)果表明，厭氧混合培養(yǎng)液濃縮樣品具有較好的抗E.coli的活性，而有氧混合培養(yǎng)液濃縮樣品及厭氧劃線法分離的單個(gè)菌落的培養(yǎng)濃縮樣品的抑菌效果不明顯（圖1）。

2.2 乙醇分級(jí)沉淀法初步分離所得樣品的抑菌活性檢測(cè)

由于厭氧混合培養(yǎng)液濃縮樣品具有較好的抑菌活性，所以通過(guò)用M9培養(yǎng)基大量培養(yǎng)獲得足夠量的濃縮樣品。然后用乙醇分級(jí)沉淀法將樣品進(jìn)行初步的分離純化，紙片法檢測(cè)各分離組抗E.coli的活性。500 mL／L以下乙醇沉淀物及900 mL／L以上的上清沒有抑菌活性。依據(jù)活性檢測(cè)結(jié)果，收集500 mL／L～900 mL／L乙醇之間的沉淀，做進(jìn)一步分離純化（圖2）。

2.3 粗提樣品柱層析分離純化及抑菌活性檢測(cè)

取50μL上述粗分離樣品上樣于TSK柱，分離得到7個(gè)明顯的洗脫峰（圖3）。將收集的7管樣品濃縮后用無(wú)菌水溶解，然后再通過(guò)紙片法進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)。如圖4所示，2、3、4、5號(hào)峰組分具有較明顯的抑菌圈。選取2號(hào)和3號(hào)峰濃縮樣品做進(jìn)一步分離純化。

2.4 RP－HPLC進(jìn)一步純化及抑菌活性檢測(cè)

將分子篩2號(hào)和3號(hào)峰濃縮樣品分別經(jīng)RPHPLC做進(jìn)一步分離，如圖5和圖6所示，2號(hào)和3號(hào)經(jīng)高相液相色譜分離后得明顯的3個(gè)峰，3個(gè)峰之后繼續(xù)收集2管。即每個(gè)峰各收集5管。抑菌活性檢測(cè)如圖7所示，3號(hào)的前3個(gè)峰具有明顯的抑菌圈。峰型分析3－1，3－2，3－3都可以進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)其成分。

圖3 凝膠過(guò)濾層析Fig.3 Gel filtration chromatography

3 討論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)細(xì)菌素的研究越來(lái)越多，并且廣泛應(yīng)用于食品中。目前細(xì)菌素在畜牧業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用還比較少，在飼料添加劑中可以有兩方面的作用，一方面是防止飼料本身被沙門菌等致病菌污染，另一方面是防止致病菌對(duì)動(dòng)物腸道的影響［12］。但對(duì)于細(xì)菌素的定義至今仍然沒有明確，公認(rèn)為是由某些細(xì)菌核糖體產(chǎn)生的非確定性的蛋白類或者肽類抗菌物質(zhì)，其分子質(zhì)量小，無(wú)抗原性，無(wú)毒副作用，選擇性地抑制或殺傷敏感菌［13］。目前有很多關(guān)于從不同動(dòng)物體或者食物中分離出各種乳酸菌，并研究其發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)的理化性質(zhì)及抑菌活性。陳新練等［14］從虎皮鸚鵡的糞便中分離出了產(chǎn)細(xì)菌素的菌株，并發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)革蘭陰性和陽(yáng)性細(xì)菌均具有較強(qiáng)的抑制作用。田召芳等［15］從健康雞、兔及豬的腸道內(nèi)容物內(nèi)分離到了能分泌抑菌活性物質(zhì)的乳酸菌，并證明分泌物中具有蛋白質(zhì)類細(xì)菌素存在。但只是初步研究了細(xì)菌素的一些特性，而并沒有分離純化。

本文先分別通過(guò)不同環(huán)境下培養(yǎng)草魚腸道微生物，通過(guò)抑菌活性檢測(cè)選擇具有能分泌具有抑菌活性物質(zhì)的厭氧培養(yǎng)法，然后擴(kuò)大培養(yǎng)獲得足夠的抗菌物質(zhì)。采用乙醇分級(jí)沉淀、凝膠過(guò)濾層析及高效液相色譜等方法對(duì)草魚腸道優(yōu)勢(shì)菌的體外培養(yǎng)分泌物進(jìn)行分離純化，獲得了比較純的具有抑菌活性的物質(zhì)。試驗(yàn)結(jié)果表明，在厭氧條件下，草魚腸道微生物能分泌具有較好抑菌活性的抗菌物質(zhì)；并且混合培養(yǎng)比單個(gè)菌落培養(yǎng)所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)更多?？赡芨鞣N優(yōu)勢(shì)菌之間相互誘導(dǎo)作用才能產(chǎn)生或產(chǎn)生更多的活性物質(zhì)，其具體原因以及產(chǎn)生細(xì)菌素的微生物類群特性需要做進(jìn)一步研究。通過(guò)質(zhì)譜分析純化所得的具有抗E.coli活性的物質(zhì)，顯示該物質(zhì)是一組親水性極強(qiáng)、分子質(zhì)量為300 ku左右的小分子混合物（質(zhì)譜圖未列于本文）。雖然是混合物，但是通過(guò)凝膠過(guò)濾層析，RP－HPLC的分離純化，說(shuō)明該組物質(zhì)的親水性、分子大小、結(jié)構(gòu)等都是極相似的。如何進(jìn)一步分離純化得到單一物質(zhì)，單一成分是否具有抑菌活性，這類物質(zhì)是否具有協(xié)同效應(yīng)，該成分的抑菌譜及理化性質(zhì)如何等都需要進(jìn)一步研究。

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