余彬輝，王斌卿，胡志航，朱炳林，李肖梁，方維煥

（1.浙江大學動物預防醫(yī)學研究所，浙江省動物預防醫(yī)學重點實驗室，浙江杭州310058；2.杭州薦量獸用生物制品有限公司，浙江杭州310018）

當今病毒性疫苗多利用轉瓶培養(yǎng)，生產(chǎn)工藝不僅費時費力，而且占用空間大，更重要的是病毒滴度不穩(wěn)定，批次之間病毒效價差異大。隨著疫苗市場的迅速發(fā)展，其生產(chǎn)技術將經(jīng)歷一場深刻的技術革新，從轉瓶培養(yǎng)向生物反應器培養(yǎng)轉變。這種轉變符合世界生物制藥發(fā)展趨勢，也表明我國疫苗生產(chǎn)技術將逐步與國際疫苗生產(chǎn)技術接軌。動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)在疫苗生產(chǎn)領域發(fā)揮著越來越重要的作用［1］。動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)和表達對生產(chǎn)疫苗有明顯的優(yōu)勢，一方面活性高、穩(wěn)定性好，是最重要的表達系統(tǒng)，但動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗還存在一定問題［2－3］，培養(yǎng)密度和產(chǎn)物濃度較低，在技術和設備上遠沒有原核細胞培養(yǎng)成熟。

目前用于動物細胞培養(yǎng)的生物反應器有很多種，但各具優(yōu)缺點［4－5］。如常見的攪拌式生物反應器，雖然混合傳氣效果較好、細胞培養(yǎng)密度高，但高的剪切力產(chǎn)生大量的細胞碎片影響產(chǎn)物質量，而且給分離帶來一定困難［6］；激流灌注式生物反應器是一種新型簡便的生物反應器［7］，可用于貼壁和懸浮兩種模式的細胞培養(yǎng)。該反應器采用一次性塑料耗材，灌注培養(yǎng)系統(tǒng)采用外循環(huán)式細胞載體灌注培養(yǎng)工藝，將裝有紙片載體的培養(yǎng)袋（即灌注系統(tǒng)）固定于反應器外，動物細胞貼壁生長于紙片載體上，通過蠕動泵及重力作用打入培養(yǎng)基，實現(xiàn)激流系統(tǒng)和灌注系統(tǒng)的循環(huán)，培養(yǎng)液供給細胞正常生長代謝所需的養(yǎng)分，帶走代謝產(chǎn)物；利用激流式生物反應器拖帶式傳氣技術在線監(jiān)控溶氧、p H、溫度等培養(yǎng)條件，為細胞生長創(chuàng)造有利的環(huán)境，同時此部分也可單獨進行懸浮細胞的培養(yǎng)。

本試驗應用激流式生物反應器培養(yǎng)MDCK細胞，通過對培養(yǎng)基、細胞接種密度、耗糖量、溶氧量、p H和溫度等參數(shù)的優(yōu)化，建立MDCK細胞生物反應器規(guī)?；瘮U繁技術，為獲得高密度細胞及在病毒疫苗生產(chǎn)中應用的奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和試劑 MDCK細胞，中國科學院細胞庫上海生命科學院產(chǎn)品；MEM、DMEM、DMEM／F12培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清，杭州四季青公司產(chǎn)品；胰酶，上海澤衡生物公司產(chǎn)品；葡萄糖測定試劑盒，為上海史瑞克生物公司產(chǎn)品；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器設備 分光光度計、高效液相色譜儀、倒置顯微鏡、AP10 4L生物反應器、溶氧電極、p H計、細胞轉瓶等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

1.2.1.1 細胞復蘇 從液氮罐中取出1管MDCK細胞于37℃快速解凍后，加到含100 mL／L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在75 cm2細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，4 h換液。待長成單層后PBS清洗1次，胰酶消化后以1∶4～1∶5的比率傳代擴繁。

1.2.1.2 轉管培養(yǎng) 加適量MDCK細胞和紙片載體于轉管中（40 mL培養(yǎng)體系），采用間歇換液法培養(yǎng)，48 h后每12 h半數(shù)換液。

1.2.1.3 激流生物反應器培養(yǎng)

1.2.1.3.1 準備工作 將激流袋和灌注袋充氣后檢漏，氣密性完好的情況下將PBS注入灌注袋浸泡紙片載體。將p H、溫度和溶氧電極分別校準后裝入盛有PBS緩沖液的不銹鋼桶中121℃高壓滅菌30 min。

1.2.1.3.2 細胞培養(yǎng) 安裝好反應器和電極后，在AP10反應器中加4 L DMEM－HG。設定條件：紙片載體100 g，p H 7.2、溶氧量（DO）50%～60%，37℃、循環(huán)速度400 mL／min、振蕩頻率60 r／min，接入1.5×106個／mL MDCK細胞進行培養(yǎng)。

1.2.2 細胞培養(yǎng)條件處理 按培養(yǎng)基種類、p H、接種密度、DO值等參數(shù)對細胞生長的影響進行以下不同處理。

1.2.2.1 培養(yǎng)基 在紙片載體0.6 g、細胞接種密度2.5×105個／mL培養(yǎng)體系為40 mL等固定條件下，分析不同培養(yǎng)基（MEM、DMEM／F12、DMEMHG或DMEM－LG）對細胞生長的影響。

1.2.2.2 p H 在紙片載體0.6 g、37℃，細胞接種密度2.5×105個／mL固定條件下，分析不同p H（6.8、7.0、7.2、7.4、7.6）對細胞生長的影響。

1.2.2.3 細胞接種密度 在紙片載體 0.6 g、DMEM－HG培養(yǎng)基、p H 為7.2、37℃，40 mL培養(yǎng)體系的條件下，細胞接種密度分別為1.25×105、2.50×105、3.75×105、5.0×105、7.5×105個／mL時的生長狀況。

1.2.2.4 溶氧量 紙片載體100 g、細胞接種密度1.5×106個／mL、搖床速度60 r／min、流量400 mL／min、p H7.2、37℃等固定條件下，DO分別設為20%～40%、50%～60%、70%～80%對細胞生長的影響。

1.2.2.5 液體流量和震蕩頻率 載紙片體100 g、細胞接種密度（1.5×106個／mL）、DO（50%～60%）、p H7.2和溫度（37℃）等固定條件下，不同液體流量（200、300、400、500 mL／min）和不同振蕩頻率（40、60、80 r／min）培養(yǎng)對細胞增殖的影響。

1.2.3 細胞生長分析 將培養(yǎng)的細胞用PBS清洗2遍后，加入含1 g／L結晶紫的檸檬酸溶液1 L于37℃溫室放置40 min揉搓搖勻后取樣計數(shù)，用細胞計數(shù)板計數(shù)，計算細胞密度。

1.2.4 細胞代謝分析

1.2.4.1 葡萄糖測定 按照葡萄糖測定試劑盒說明書進行。

1.2.4.2 氨基酸測定 按照氨基酸測定試劑盒說明書進行。

1.2.4.3 紙片貼壁率計算

貼壁率（%）＝X1／X0×100%

X0代表接種時的細胞量，X1代表3h后紙片載體上的細胞貼壁數(shù)。

2 結果

2.1 不同培養(yǎng)基對MDCK細胞生長和代謝的影響

DMEM－HG培養(yǎng)MDCK細胞5 d，細胞密度達到最高（3.2×106個／mL，圖1A）；采用DMEM－HG培養(yǎng)基，利用間歇換液法培養(yǎng)第6天細胞密度達到最高（3.46×106個／mL，圖1B）。

圖1 不同培養(yǎng)基對MDCK細胞生長和比生長速率的影響Fig.1 Effects of different media on cell density and specific growth rates in MDCK cells

2.2 細胞接種密度對MDCK細胞生長和代謝的影響

在載體量0.6 g、間歇換液法培養(yǎng)5 d的條件培養(yǎng)MDCK細胞，結果表明接種密度越大糖耗越高；同時糖耗高峰期也隨細胞量的增大而提前，但細胞產(chǎn)量卻不和接種密度成正比（表1）。

表1 接種密度對MDCK細胞生長的影響Table1 Effect of cell density on MDCK cell growth

2.3 p H對MDCK細胞生長的影響

圖2表明，MDCK細胞在p H7.2時細胞密度最高（1.04×107個／mL），因此7.2為最適p H。

圖2 p H對MDCK細胞生長的影響Fig.2 Effect of p H on MDCK cell growth

2.4 DO值、循環(huán)流量及振蕩頻率對MDCK細胞生長和代謝的影響

在相同條件（接種密度1.5×106個／mL、p H 7.2、37℃、培養(yǎng)6 d，分別固定DO值、循環(huán)流量和振蕩頻率進行反應器培養(yǎng)細胞優(yōu)化試驗。從圖3看出，DO值50%～60%，循環(huán)流量400 mL／min和振蕩頻率60 r／min條件下可收獲最大量細胞（17.8×106、16.4×106、18.6×106個／mL）。

2.5 激流生物反應器培養(yǎng)MDCK細胞

圖4表明細胞在第5天達到最高耗糖量（3.1 g／L）和最高細胞密度（1.02×107個／mL）；第2天達到最大比生長速率。整個培養(yǎng)過程中利用氣體流通開放式進行培養(yǎng)，因此氨濃度為零。從圖4B看出，乳酸的最大濃度為28.1 mmo L／L，而氨基酸從第4天以后為零，因此在生產(chǎn)中根據(jù)需要補充氨基酸。

圖3 DO、循環(huán)流量和振蕩頻率對細胞生長的影響Fig.3 Effects of DO，circulation flow and oscillation rate on cell growth

3 討論

傳統(tǒng)轉瓶生產(chǎn)工藝是目前成熟的疫苗培養(yǎng)方法，但由于操作繁瑣，傳代環(huán)節(jié)多，易污染及產(chǎn)品質量難于控制是其大規(guī)模應用的主要障礙。激流式生物反應器采用紙片載體培養(yǎng)模式，紙片載體呈三維立體結構，可增加細胞黏附生長面積。該模式易于細胞生長及營養(yǎng)供給，培養(yǎng)過程可采用連續(xù)灌注培養(yǎng)，不斷加入新鮮培養(yǎng)液的同時排出舊液，能有效供給營養(yǎng)除去代謝產(chǎn)物，使細胞始終處于良好的營養(yǎng)狀態(tài)，適用于高密度細胞培養(yǎng)，同時延長細胞維持時間，有利于病毒的持續(xù)繁殖，提高疫苗產(chǎn)量［8－10］。

MDCK細胞在培養(yǎng)過程中需要消耗大量的糖，在糖耗完后就利用氨基酸作為碳源［11］。D／F12、MEM和DMEM－LG培養(yǎng)基中葡萄糖在第3天便耗完，而 DMEM－HG 在第5天 才 耗 完，因 此DMEM－HG最適于 MDCK細胞生長。代謝過程中，氨離子濃度很低，但乳酸的產(chǎn)量較高，因此培養(yǎng)到48 h進行全換液。每24 h取樣檢測耗糖量，根據(jù)檢測情況及時補充葡萄糖和氨基酸。

本試驗采用48 h后每12 h半數(shù)換液的方式，消除代謝產(chǎn)物給細胞帶來的不利影響［11－12］。單純從細胞培養(yǎng)密度出發(fā)，換液培養(yǎng)要比不換液高2倍，同時細胞生長對數(shù)周期短、倍增時間快，利于細胞保持良好狀態(tài)，便于提前接種病毒。激流式生物反應器培養(yǎng)MDCK細胞，在細胞密度、擴增倍數(shù)、比生長速率等方面都明顯優(yōu)于轉瓶培養(yǎng)，此外它能減少污染、節(jié)約空間和人力［13］。激流式生物反應器是靠激流供氧，因此是機械剪切力小、混合性能好的新型供氧培養(yǎng)系統(tǒng)［14］。另外，激流式反應器附有呼吸袋，因此細胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的氨等不利氣體通過呼吸袋排出培養(yǎng)系統(tǒng)。

圖4 激流生物反應器培養(yǎng)MDCK細胞Fig.4 Cultivating MDCK cells in AP10 4L bioreactor

［1］Jesus M D，Wurm F M.Manufacturing recombinant proteins in kg－ton quantities using animal cells in bioreactors［J］.Eur J Pharm Biopharm，2011，78（2）：184－188.

［2］Garcia－Ochoa F，Gomez E.Bioreactor scale－up and oxygen transfer rate in microbial processes：An overview ［J］.Biotechnol Adv，2009，27（2）：153－176.

［3］Huang T K，McDonald K A.Bioreaetor engineering for recombinant protein production in plant cell suspension cultures［J］.Biochem Eng J，2009，45（3）：168－184.

［4］Wang D，Liu W，Han B，et al.The bioreactor：a powerful tool for large－scale culture of animal cells［J］.Curr Pharm Biotechnol，2005，6（5）：397－403.

［5］Kehoe D E，Jing D，Lock L T，et al.Scalable stirred－suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells［J］.Tissue Eng Part A，2010，16（2）：405－421.

［6］唐江偉，吳振強.新型生物反應器結構研究進展 ［J］.中國生物工程雜志，2007，27（5）：146－152.

［7］Li L，Shi M，Song Y，et a1.A Single－use，sealable perfusion bioreactor system［J］.Bio Process Int，2009，7（6）：46－54.

［8］Genzel Y，Dietzsch C，Rapp E，et al.MDCK and Vero cells for influenza virus vaccine production：a one－to－one comparison up to lab－scale bioreactor cultivation［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，88（2）：461－475.

［9］Trabelsi K，Majoul S，Rourou S，et al.Development of a measles vaccine production process in MRC－5 cells grown on Cytodex1 microcarriers and in a stirred bioreactor［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2012，93（3）：1031－1040.

［10］Liu C C，Guo M S，Lin F H，et al.Purification and characterization of enterovirus 71 viral particles produced from vero cells grown in a serum－free microcarrier bioreactor system［J］.PLoS One，2011，6（5）：e20005.

［11］Linz M，Zeng A P，Wagner R，et al.Stoichiometry，kinetics，and regulation of glucose and amino acid metubolism of a recombinant BHK cell line in batch and continous cultures［J］.Biotechnol Prog，1997，13（4）：453－463.

［12］Zielke H R，Zielke C L，Ozand P T.Glutamine：a major energy source for cultured mammalian cell ［J］.Fed Proc，1984，43（1）：121－125.

［13］韓德勝，李振平.微載體規(guī)?；囵B(yǎng)細胞的研究 ［J］.微生物學免疫學進展，2005，33（3）：34－36.

［14］劉 軼，朱國強.動物細胞培養(yǎng)及微載體技術研究進展 ［J］.吉林農業(yè)大學學報，2007，29（2）：203－206.