范闊海，張 蓓，李娟娟，李宏全

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801）

天然來(lái)源的多糖是一類(lèi)大分子，它對(duì)免疫系統(tǒng)有重要影響，因此在臨床應(yīng)用上可能作為一種免疫調(diào)節(jié)劑［1－2］。黃芪多糖 （Astrgaluspolysaccharides，APS）是從中藥黃芪中提取出的多糖類(lèi)物質(zhì)［3］。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，APS具有增強(qiáng)或調(diào)節(jié)免疫的功能，Li研究證明APS通過(guò)調(diào)節(jié)體液免疫和細(xì)胞免疫對(duì)Ⅰ型糖尿病的小鼠有免疫治療作用［4］；Kong X 等［5］通過(guò)體內(nèi)和體外試驗(yàn)證明，APS通過(guò)促進(jìn)外周淋巴細(xì)胞增殖和增加血清中抗體來(lái)發(fā)揮增強(qiáng)免疫的作用。豬源抗菌肽PG－1屬于Cathelicidin家族，具有廣譜抗菌活性，在動(dòng)物機(jī)體免疫中發(fā)揮著重要的作用［6－7］。Cathelicidin 基因的 5′端啟動(dòng)子區(qū)域包含NF－κB、NF－IL－6和IL－6等調(diào)控因子結(jié)合的位點(diǎn)，這表明Cathelicidin基因的表達(dá)可能被這些因子所調(diào)控［8－9］。Wu H 等［10］將脂多糖（LPS）、白介素－6（IL－6）、全反式視黃酸（ATRA）與豬骨髓細(xì)胞一起進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過(guò)Northern blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)上清液中的PG－1和PR－39mRNA表達(dá)水平顯著增加。但黃芪多糖對(duì)仔豬的免疫調(diào)控作用如何以及發(fā)揮作用的機(jī)制尚不清楚。本試驗(yàn)通過(guò)給仔豬體內(nèi)注射AHPS注射劑，設(shè)定不同的劑量組，研究主要產(chǎn)生IL－6的T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的活性，檢測(cè)IL－6的表達(dá)量和PG－1基因的表達(dá)水平，分析T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的活性、IL－6的表達(dá)量、PG－1基因的表達(dá)水平與AHPS劑量的相關(guān)性，來(lái)研究黃芪多糖對(duì)仔豬的免疫調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 按照本課題組報(bào)道的微波萃取法制備 AHPS［11－13］，參 考 《中 國(guó) 藥 典 》自 制 AHPS 注 射劑，通過(guò)中藥制劑的9項(xiàng)安全檢查確定自制注射劑可用于動(dòng)物試驗(yàn)。淋巴細(xì)胞分離液，天津?yàn)笊镉邢薰井a(chǎn)品；Trizol試劑，Invitrogen公司產(chǎn)品；豬IL－6ELISA 試 劑 盒，美 國(guó) R○RD 公 司 產(chǎn) 品；DNA Marker DL2000和 SYBR PrimeSciptTM RT－PCR Kit（Perfect Real Time），寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 組織材料 12頭健康杜長(zhǎng)大雜交仔豬，體重為10kg±1kg，20日齡仔豬購(gòu)自山西天祿豐種豬育種有限公司養(yǎng)豬場(chǎng)，未注射過(guò)疫苗，健康，觀察飼養(yǎng)15 d后，將其隨機(jī)分為4組（每組3頭），其中1組為對(duì)照組，3組分別為注射50、100、200mg／kg體重劑量的AHPS試驗(yàn)組，每日注射1次，連續(xù)注射7d。注射黃芪多糖的第1、3、5、7天采血，分抗凝血和非抗凝血兩種，分別用于T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的增殖活性和IL－6含量的檢測(cè)；第7天采血后處死仔豬，無(wú)菌條件下取股骨骨髓，置于DEPC處理過(guò)的EP管中，立即放入液氮中保存，用于總RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的增殖活性檢測(cè)在2mL抗凝血中加等體積的無(wú)血清RPMI Medium 1640培養(yǎng)基，將其緩慢加入至淋巴細(xì)胞分離液中，離心分層，吸取灰白色的中間層，主要為外周血單個(gè)核細(xì)胞。用含100mL／L胎牛血清的RPMI－1640重懸洗滌后的外周血單個(gè)核細(xì)胞，接種至一次性培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后，非貼壁細(xì)胞為淋巴細(xì)胞（97%以上為T(mén)淋巴細(xì)胞），貼壁細(xì)胞即為單核細(xì)胞。將非貼壁細(xì)胞懸液吸出離心，1 000 r／min，10min，棄上清，加含100mL／L胎牛血清的RPMI－1640重懸；將貼壁的單核細(xì)胞用2.5g／L胰蛋白酶進(jìn)行消化，37℃培養(yǎng)箱中消化15min，胎牛血清終止消化，加完全RPMI－1640培養(yǎng)基重懸，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)測(cè)活性均在95%以上，將細(xì)胞濃度均調(diào)整為1×106個(gè)／mL。用MTT法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的增殖活性。

1.2.1.1 MTT法測(cè)定T淋巴細(xì)胞活性 于96孔培養(yǎng)板中加入T淋巴細(xì)胞懸液100μL，使每孔細(xì)胞為1×105個(gè)，每頭豬做了5個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)無(wú)細(xì)胞孔作為調(diào)零孔及試驗(yàn)孔。用完全RPMI1640培養(yǎng)基將每孔補(bǔ)至200μL，試驗(yàn)孔加入CoA（終濃度為5 μg／mL），在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，培養(yǎng)結(jié)束前4h，從每孔吸出100μL上清，再加 MTT（5μg／mL）15μL，繼續(xù)培養(yǎng)，結(jié)束前將上清完全棄去，然后加150μL DMSO溶解細(xì)胞，10min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD 590nm值，來(lái)判定淋巴細(xì)胞的增值情況。

1.2.1.2 MTT法測(cè)單核細(xì)胞活性 于96孔培養(yǎng)板中加入100μL單核細(xì)胞懸液，使每孔細(xì)胞為1×105個(gè)，每頭做5個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)無(wú)細(xì)胞孔為調(diào)零孔。用完全RPMI1640培養(yǎng)基將沒(méi)孔補(bǔ)至200μL，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h使單核細(xì)胞貼壁，從每孔吸出100μL上清，每孔加入15μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，將上清完全棄去，加150μL DMSO溶解細(xì)胞，10min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD 590nm值，來(lái)判定單核細(xì)胞的增殖情況。

所有測(cè)定數(shù)據(jù)結(jié)果用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，對(duì)結(jié)果進(jìn)行因果方差分析Duncan′s多重比較。結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示。

1.2.2 IL－6含量檢測(cè) 將采取的非抗凝血，3 000 r／min離心20min，吸出上清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)上清中IL－6的含量。ELISA試驗(yàn)數(shù)據(jù)用CurveExpert 1.3分析得出，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差（One－Way ANVOA）分析，進(jìn)行t檢驗(yàn)，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)都以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示。

1.2.3 骨髓PG－1mRNA表達(dá)水平的測(cè)定

1.2.3.1 骨髓總RNA的提取與引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的步驟，提取骨髓總RNA，電泳檢測(cè)完整性，使用ND－1000微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度。根據(jù)NCBI公布的豬PG－1和β－actin基因序列，借助Primer5.0plus軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1），由北京華大基因研究中心合成。

表1 目的基因和內(nèi)參基因的引物序列Table 1 Sequences of primers of target and house－keeping gene

1.2.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將提取的各樣本RNA濃度歸為同一濃度，按照寶生物工程（大連）有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒方法，以O(shè)ligo（dT）為反轉(zhuǎn)錄引物，合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件為37℃15min，85℃5s。

取反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，以特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系物為25μL：cDNA 2μL，dNTPs 2μL，10×buffer 2.5μL，特異上下游引物0.5μL，TaqE 0.25μL，無(wú)菌水17.75μL。反應(yīng)條件：95℃10s；95℃5s，58℃20s，72℃20s，40個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物用20g／L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將目的條帶切割回收后送交寶生物工程（大連）有限公司雙引物測(cè)序。

取反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，按照2倍梯度稀釋5個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。每個(gè)樣品分別使用PG－1基因和β－actin基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR擴(kuò)增，反應(yīng)分別在密閉的定量PCR管中進(jìn)行。反應(yīng)體系：SYBR?Premix ExTaqTM （2×）12.5μL、PCR Forward Primer 0.5μL、PCR Reverse Primer 0.5 μL、cDNA溶液1μL、ROX Reference DyeⅡ（50×）0.5μL、加dH2O至25μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10s；95℃10s，58℃ 15s，72℃ 20s，45個(gè)循環(huán)；95℃1min，55℃30s，95℃30s。每個(gè)樣本、PG－1基因、β－actin基因重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束，由熔解曲線(xiàn)判定PCR反應(yīng)的特異性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以及熒光曲線(xiàn)的CT值計(jì)算定量結(jié)果（結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示）。通過(guò)2－△△CT法計(jì)算PG－1在不同劑量組和對(duì)照組中的基因相對(duì)表達(dá)水平，△CT目的基因＝CT目的基因－CT內(nèi)參基因，△△CT＝△CT劑量組－△CT對(duì)照組，PG－1mRNA表達(dá)差別倍數(shù)以2－△△CT表示。

2 結(jié)果

2.1 黃芪多糖對(duì)T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞增殖活性的影響

在注射AHPS同一時(shí)間段內(nèi)，不同劑量下，MTT法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，注射后第3天與對(duì)照組相比，高劑量組和中劑量組的T淋巴細(xì)胞增殖活性差異極顯著（P＜0.01），而低劑量組差異不顯著（P＞0.05）；注射后第5天與對(duì)照組相比，高、中劑量組均差異極顯著（P＜0.01），低劑量組差異顯著（P＜0.05）；注射后第7天與對(duì)照組相比，高、中劑量組均差異極顯著（P＜0.01），低劑量組差異顯著（P＜0.05）（圖1A）。檢測(cè)單核細(xì)胞增殖結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析顯示，在注射APS后的第3、5、7天的時(shí)候，高、中、低劑量組的單核細(xì)胞增殖活性與對(duì)照組相比，均差異極顯著（P＜0.01）（圖1B）。

圖1 黃芪雜多糖對(duì)仔豬外周血中的T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞增值活性的影響Fig.1 Effect of AHPS on proliferation of T lymphocytes and monocytes in the peripheral blood of piglets

2.2 IL－6含量的檢測(cè)

ELISA檢測(cè)血清中IL－6含量的統(tǒng)計(jì)分析顯示，在注射AHPS后的第3、5、7天，AHPS處理的各組的IL－6含量均顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），IL－6含量隨著注射天數(shù)的增加逐漸增加。除第1天外，在注射的相同時(shí)間內(nèi)，IL－6含量變化呈劑量依賴(lài)性增加（圖2）。

2.3 骨髓中PG－1mRNA的表達(dá)水平

通過(guò)2－△△CT法計(jì)算PG－1在注射不同劑量的AHPS后的基因相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，PG－1基因在低、中、高劑量組的表達(dá)水平分別是對(duì)照組的1.6174、2.0556和2.7132倍，且呈劑量依賴(lài)性增加（圖3）。

3 討論

黃芪藥理作用廣泛，能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)細(xì)胞代謝，調(diào)節(jié)DNA復(fù)制及RNA和蛋白質(zhì)的合成［14］，黃芪多糖提取于黃芪，大量研究證明APS作為免疫調(diào)節(jié)劑在免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。Chen H L等［15］通過(guò)體外和體內(nèi)試驗(yàn)均已證明APS通過(guò)促進(jìn)外周淋巴細(xì)胞增殖、增肌血清抗體、增加一氧化氮（NO）和白介素－2（interleukin－2）的產(chǎn)生來(lái)發(fā)揮潛在的免疫刺激活性。APS還可激活小鼠的B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞［16－17］。T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞在機(jī)體免疫中發(fā)揮著重要的作用，其中T淋巴細(xì)胞主要來(lái)源于骨髓的多能干細(xì)胞，參與機(jī)體的細(xì)胞免疫。而單核細(xì)胞代表機(jī)體總的細(xì)胞免疫水平［18］，抗體的產(chǎn)生、細(xì)胞因子的釋放、細(xì)胞殺傷作用的變化等都是以此為基礎(chǔ)的。激活的單核細(xì)胞能產(chǎn)生并釋放大量的多種的細(xì)胞毒素、干擾素和白介素，參與機(jī)體的防衛(wèi)機(jī)制，而活化的T淋巴細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞是主要產(chǎn)生IL－6的免疫細(xì)胞。IL－6可促進(jìn)多種細(xì)胞的增值和分化，它的這種多能性是由廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞表面的IL－6受體介導(dǎo)的，可以通過(guò)其受體活化胞內(nèi)的一系列信號(hào)蛋白分子從而實(shí)現(xiàn)反應(yīng)基因的誘導(dǎo)表達(dá)［19］。研究表明IL－6主要有Jak／STAT和 Ras／NF－IL－6這兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，轉(zhuǎn)錄因子STAT3（signal transducer and activator of transcription，STATs）和 NF－IL－6分別參與這兩條通路。當(dāng)作用細(xì)胞受到IL－6的刺激后，其受體活化激活這兩條通路中的JAK激酶和MAPK激酶，進(jìn)而使轉(zhuǎn)錄因子Stat3和NF－IL－6磷酸化，活化了的Stat3和NF－IL－6可與反應(yīng)蛋白基因中啟動(dòng)子區(qū)域的IL－6反應(yīng)成分結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)基因的誘導(dǎo)表達(dá)［20］。

圖2 血清中IL－6含量Fig.2 IL－6contents in serum

圖3 不同黃芪多糖注射劑量對(duì)骨髓PG－1mRNA表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of APS on the expression level of PG－1mRNA in marrow

目前已經(jīng)確認(rèn)在抗菌肽Protegrins中，其前3個(gè)外顯子編碼的前導(dǎo)肽序列的5′端的調(diào)控區(qū)域中存在幾個(gè)潛在的調(diào)控模塊，在這個(gè)區(qū)域中存在著與動(dòng)物免疫密切相關(guān)的NF（nuclesr factors）因子結(jié)合位點(diǎn)，如 NF－κB、NF－IL－6、IL－6反應(yīng)因子、APRE（急性炎性反應(yīng)因子）、γ干擾素反應(yīng)因子和細(xì)菌LPS（脂多糖）［21］。根據(jù)大量研究結(jié)果可以推測(cè)一些免疫調(diào)節(jié)劑是通過(guò)IL－6調(diào)控PG－1的表達(dá)。以此為出發(fā)點(diǎn)，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)比不同劑量AHPS注射組與空白對(duì)照組的仔豬血液內(nèi)的T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的增殖活性、IL－6含量，骨髓中PG－1基因的表達(dá)水平，并將它們之間的相關(guān)性進(jìn)行分析表明，AHPS肌肉注射于豬體內(nèi)后，機(jī)體內(nèi)生成IL－6的T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的活性增強(qiáng)，IL－6的含量增加，使抗菌肽PG－1的表達(dá)量升高，證實(shí)了體內(nèi)注射黃芪多糖所產(chǎn)生這樣的結(jié)果的機(jī)理是和體外試驗(yàn)的結(jié)果一致，AHPS 誘 導(dǎo)IL－6 的 產(chǎn) 生，IL－6刺 激 Stat3 和NF－IL－6活化，從而上調(diào)PG－1表達(dá)。具體的作用機(jī)制需進(jìn)一步的研究。

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