姚 琳，王韻箎，鞠玉琳

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉 133002）

剛地弓形蟲（Toxoplasmagondii）是一種機會 性寄生原蟲，在細胞免疫功能缺陷、受損或者先天性弓形蟲感染的人群中常有較高的發(fā)病率和死亡率［1－3］，剛地弓形蟲可感染人和多種動物，引起人獸共患弓形蟲病。李佳佳等［4］證明樺褐孔菌多糖能促進急性感染弓形蟲小鼠細胞因子IL－2、IFN－γ的釋放，達到抗弓形蟲的目的。本試驗通過研究樺褐孔菌多糖對急性感染弓形蟲小鼠血清中細胞因子IL－12、IL－1β的影響，為樺褐孔菌多糖治療急性感染弓形蟲小鼠早期作用機制提供理論依據(jù)，進一步在分子免疫水平上探討樺褐孔菌多糖抗弓形蟲的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 樺褐孔菌多糖的提取方法在文獻［5］方法的基礎(chǔ)上進行改良，獲得的樺褐孔菌多糖含量為49.45%。小鼠血清IL－12、IL－1βELISA檢測試劑盒，購自RB公司。

1.1.2 蟲株與實驗動物 弓形蟲RH株由日本帶廣原蟲病研究所惠贈，延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院藥理實驗室保種，液氮保存。昆明種小鼠，體重18g～22g，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院小動物實驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 急性感染弓形蟲小鼠模型的建立 接種RH株的小鼠72h后處死，并用生理鹽水洗滌腹腔，適當(dāng)稀釋后計數(shù)備用。除陰性組外，其余各組小鼠腹腔接種RH株弓形蟲速殖子102個／只，陰性組小鼠腹腔注射生理鹽水0.2mL／只。在感染前3d開始灌胃樺褐孔菌多糖，總共6d。

1.2.2 小鼠血清的制備及細胞因子IL－12、IL－1β的測定 取健康雄性昆明種小鼠45只，隨機分為3組，即陰性組，急性感染弓形蟲小鼠模型組，樺褐孔菌多糖試驗組。陰性組及模型組每天灌胃蒸餾水0.2mL／只，試驗組每天灌胃樺褐孔菌多糖0.2 mL／只。于接種后12、24、36、48、60h摘眼球采血，分離血清，置－20℃保存?zhèn)溆?。用時分別將IL－1β、IL－12組待測血清原倍、100倍稀釋，按試劑盒說明書進行測定，根據(jù)所給標準品繪制標準曲線，將OD值換算成濃度（pg／mL）。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計 對試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果用±SD表示。數(shù)據(jù)差異顯著性采用SPSS12.0軟件進行單因素ANOVA t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清中IL－12的測定

分別在12、24、36、48、60h采集陰性組、模型組、試驗組的小鼠全血，分離血清，用時將待測血清稀釋100倍，按試劑盒說明書進行測定，將OD值換算成濃度如表1所示。

由表1可知，陰性組中不同時間之間無顯著性差異（P＞0.05）；模型組中不同時間比較均呈極顯著差異（P＜0.01）；試驗組中24h和60h比較差異不顯著（P＞0.05），12、36、48h相比較均呈極顯著差異 （P＜0.01）；模型組和試驗組與陰性組比較均呈極顯著差異 （P＜0.01）；模型組及試驗組IL－12的峰值均出現(xiàn)在36h，48h開始下降，但試驗組IL－12值一直高于陰性組，低于模型組。

2.2 小鼠血清中IL－1β的測定

分別在12、24、36、48、60h采集陰性組、模型組、試驗組的小鼠全血，分離血清，按試劑盒說明書進行測定，將OD值換算成濃度如表2所示。

表1 各組小鼠不同時間血清中IL－12水平比較Table1 The serum level of IL－12in different time among different groups in mice

表2 各組小鼠不同時間血清中IL－1β水平比較Table 2 The serum level of IL－1βin different time among different groups in mice

由表2可知，陰性組中不同時間之間無顯著性差異（P＞0.05）；模型組中不同時間比較均呈極顯著差異（P＜0.01）；試驗組中12、48、60h比較差異不顯著（P＞0.05），24h和36h比較呈極顯著差異（P＜0.01）；模型組和試驗組與陰性組比較均呈極顯著差異 （P＜0.01）；模型組及試驗組的IL－1β峰值均出現(xiàn)在24h，36h開始下降，但試驗組IL－1β值一直高于陰性組，低于模型組。

3 討論

宿主感染弓形蟲后，多種細胞和細胞因子在機體免疫中起重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)29種白介素（IL），在細胞間相互作用、免疫調(diào)節(jié)、造血以及炎癥過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能［6］。IL－1β由活化的巨噬細胞產(chǎn)生，是早期免疫反應(yīng)的介質(zhì)，能促進IL－2、IFN－γ等細胞因子的產(chǎn)生，增強細胞毒性T淋巴細胞和 NK 細胞的殺蟲活性。IL－12［7－8］由巨噬細胞分泌，其通過誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)T淋巴細胞、NK細胞、淋巴因子活化的殺傷細胞等產(chǎn)生IFN－γ、TNF－α等細胞因子來殺傷弓形蟲［9］。本研究結(jié)果顯示，用藥3d后模型組和試驗組小鼠血清中細胞因子IL－12和IL－1β表達量分別在36h和24h達到高峰，而后呈現(xiàn)下降趨勢，而試驗組于用藥3d后在12h～60h期間IL－12、IL－1β值一直高于陰性組，低于模型組，表明樺褐孔菌多糖能夠抑制急性感染弓形蟲小鼠血清中細胞因子IL－1β、IL－12的過度釋放。至于樺褐孔菌多糖對急性感染弓形蟲小鼠血清中細胞因子IL－12和IL－1β的調(diào)節(jié)，是否通過影響IL－2、IFN－γ而間接達到抗蟲目的，還有待于進一步研究。

李佳佳等［5］試驗結(jié)果證明，樺褐孔菌多糖可使急性感染弓形蟲小鼠血清中IFN－γ、IL－2值升高到適當(dāng)水平，并可有效調(diào)節(jié)染蟲小鼠CD4＋、CD8＋T細胞比例；劉妍等［10－11］的病理學(xué)試驗結(jié)果證明，樺褐孔菌多糖能減輕染蟲小鼠病理損傷，提高染蟲小鼠生殖器官機能，促進染蟲小鼠及孕鼠功能胎鼠的發(fā)育。本試驗結(jié)果表明，樺褐孔菌多糖能夠抑制急性感染弓形蟲小鼠血清中細胞因子IL－1β、IL－12的過度釋放。上述結(jié)果充分的說明樺褐孔菌多糖能有效的通過調(diào)節(jié)小鼠的細胞免疫功能來減輕弓形蟲病對機體的傷害。本試驗用為樺褐孔菌多糖治療急性感染弓形蟲小鼠早期作用機制提供了科學(xué)依據(jù)，同時為弓形蟲病的防控提供了新思路。

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