李建輝，左玉柱，孫彥欣，范京惠

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定 071001）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是豬的一種高度接觸性傳染病，可引起母豬的生殖障礙以及仔豬嚴重的呼吸道疾病和高病死率［1］。本病的病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），該病毒感染具有兩個主要特征，一是持續(xù)性的感染，二是免疫抑制作用［2］。PRRSV主要結(jié)構(gòu)蛋白有E蛋白、M蛋白和N蛋白，其中E蛋白即GP5蛋白，由病毒ORF5基因編碼。GP5蛋白是PRRSV的囊膜糖蛋白，在病毒感染宿主細胞過程中起著重要作用，同時，還能刺激機體產(chǎn)生中和抗體［3］。但該蛋白含有的3個疏水跨膜區(qū)使得應(yīng)用多種表達系統(tǒng)均難以獲得GP5全基因的高效表達［4］。陳軍義等［5］曾去除了 N末端的信號肽部分，擴增了GP5全基因中79bp～600 bp的基因片段，并成功地表達了GP5蛋白。Oleksiewicz M B等［6］從噬菌體12肽庫中鑒定出一個高度保守的中和表位，即B表位。此外，在位于B表位的7個氨基酸之前，還有一高變異性的免疫優(yōu)勢區(qū)域稱為A表位，該表位在感染后快速產(chǎn)生非中和抗體。這些特征使得A表位可能成為誘騙表位，從而減少針對鄰近NE的保護性反應(yīng)。顧小雪等［7］擴增了只包括A表位和B表位的一段小肽的基因片段，雖然成功表達，但并不能產(chǎn)生中和抗體。因此，為了獲得含有中和活性的PRRSV－GP5蛋白，本研究根據(jù)PRRSV－GP5蛋白的結(jié)構(gòu)特點，擴增去除信號肽及A表位的GP5基因獲得dGP5，并對表達的PRRSV－dGP5融合蛋白進行SDS－PAGE和 Western blot分析，以期為深入研究PRRSV GP5蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX－6p－1載體和豬PRRS陽性血清均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院微生物實驗室保存；100bp DNA Lander、預(yù)染蛋白Marker購自北京全是金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、Simple－T 載 體、TaqDNA 聚 合 酶、DL 2 000 DNA plus Marker、T4DNA連接酶等購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒為康維世紀生物科技有限公司，HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG購自北京索萊寶科技有限公司；6份病料（肺臟）采自河北省保定地區(qū)臨床上疑似PRRS的病豬，并經(jīng)PCR診斷試劑盒檢測為陽性。

1.2 方法

1.2.1 PRRSV GP5基因擴增、克隆及鑒定 根據(jù)GenBank中發(fā)表的PRRSV GP5全基因序列，使用Primer5.0 軟 件 設(shè) 計 合 成 特 異 性 引 物。P1：5′－GGATCCAAGCTTATGTTGGGGAAA－3′；P2：5′－CCATGGCTCGAGCTAGAGACGAC－3′。 用 Trizol方法提取PRRSV總RNA，用隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，進行PCR擴增，目的片段的擴增條件為：95℃5min；94℃30s，52℃45s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、回收后與pMD18－T Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α。經(jīng)質(zhì)粒抽提、PCR鑒定正確后送天根公司測序，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pMD－GP5。

1.2.2 dGP5引物的設(shè)計與目的基因的PCR擴增

由于GP5蛋白在表達系統(tǒng)中難以表達，在設(shè)計引物P3、P4時將氨基端疏水性較強的信號肽序列去掉。根據(jù)Simple－T克隆載體以及pGEX－6p－1表達載體的特點，用Primer5.0軟件設(shè)計特異性引物，并在上游引物引入BamHⅠ酶切位點，下游引物引入EcoRⅠ酶切位點，預(yù)期大小為513bp。引物由天根公司合成，分別為P3：GGATCCATGAGCAACAGCAACAG；P4：GAATTCCTAGAGACG －ACCCCATT。

以重組質(zhì)粒pMD－GP5為模板，PCR擴增截短后的GP5基因，反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃40 s，51.7℃40s，72℃1min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收DNA試劑盒進行純化回收。

1.2.3 dGP5基因重組表達載體的構(gòu)建 將純化回收的dGP5基因擴增產(chǎn)物克隆至pMD18－T載體，命名為pMD18－T－dGP5。再用BamHⅠ和EcoRⅠ同時分別雙酶切 pMD18－T－dGP5和表達載體pGEX－6p－1，經(jīng)T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細胞，命名為pGEX－6p－dGP5。提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞，進行PCR和雙酶切鑒定以及序列測定。

1.2.4 重組表達載體的誘導(dǎo)表達 挑取含陽性重組表達質(zhì)粒的單菌落，接種于含有氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至D600nm到0.7，加入終濃度為1mmol／L的IPTG。在30℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后2、3、4、6h取菌。將不同時間取的菌液12 000r／min離心1min，棄上清，再用PBS重懸菌液沉淀，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸變性5min，12 000r／min離心1min，取上清。

1.2.5 重組蛋白的SDS－PAGE鑒定 將分離膠與濃縮膠配好，加樣時設(shè)置空載體和誘導(dǎo)前菌體作對照。電壓在濃縮膠內(nèi)為90V，在分離膠內(nèi)為110V。電泳后，用考馬斯亮藍染色1h左右，再在脫色液中脫色2h，期間更換脫色液2次～3次，直到蛋白區(qū)域清晰為止。檢查重組蛋白的表達情況。

1.2.6 重組蛋白的 Western blot分析 將重組蛋白進行SDS－PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印到NC膜。濕轉(zhuǎn)3h后再轉(zhuǎn)移至5 0g／L的脫脂奶粉封閉液中，4℃過夜。次日加入1∶100的豬PRRSV陽性血清（一抗）。室溫下作用3h后，用TBST洗膜3次，每次6 min，然后加入1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG（二抗），室溫振蕩1h；洗滌同上。最后在暗處將洗滌后的NC膜放入新配置的DAB底物顯色液中顯色3min～5min，直至條帶清晰后迅速用去離子水終止顯色反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PRRSV GP5基因的擴增

應(yīng)用RT－PCR方法從疑似病豬的病料中擴增出了大小約為600bp的特異性條帶，與預(yù)期大小相符（圖1）。

2.2 原核表達質(zhì)粒pGEX－6p－dGP5的構(gòu)建與鑒定

以pMD－GP5為模板，P3和P4為引物，進行dGP5基因擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切連接至pGEX－6P－1，重組質(zhì)粒通過PCR擴增和酶切進行鑒定。由圖2和圖3可知，應(yīng)用PCR方法從重組質(zhì)粒中擴增出約500bp左右的特異性基因片段，對重組質(zhì)粒進行雙酶切，分別獲得與空載體對照相一致的約4 360bp左右基因片段和約500bp左右的dGP5基因片段，將PCR和雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進行測序，并將陽性重組質(zhì)粒命名為pGEX－6p－dGP5。

2.3 表達產(chǎn)物的SDS－PAGE分析

將含有陽性重組質(zhì)粒的大腸埃希菌用IPTG誘導(dǎo)，在不同誘導(dǎo)時間取樣，并經(jīng)SDS－PAGE檢測，結(jié)果在約40ku處可見表達條帶，與預(yù)期蛋白大小相一致（圖4），而未誘導(dǎo)菌和空載體菌誘導(dǎo)后，均沒有出現(xiàn)此蛋白條帶，且在誘導(dǎo)后4h表達量最高。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.GP5基因的PCR產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2 000；1.PCR products of GP5gene

圖1 RT－PCR擴增的GP5基因Fig.1Amplification of GP5gene by RT－PCR

圖2 重組質(zhì)粒pGEX－6p－dGP5的PCR鑒定Fig.2Identification of pGEX－6p－dGP5gene by PCR

圖3 重組質(zhì)粒pGEX－6p－dGP5的酶切鑒定ig.3Identification of the plasmid pGEX－6p－dGP5by enzyme digestion

圖4 誘導(dǎo)不同時間重組菌的SDS－PAGE分析Fig.4SDS－PAGE analysis of pGEX－6p－dGP5induced in different time

2.4 Western blot鑒定

DAB顯色后，在約40ku處有特異性條帶，而陰性空載體誘導(dǎo)對照無此特異性反應(yīng)。證明重組的dGP5在大腸埃希菌中獲得了正確表達，且表達蛋白具有良好的抗原性（圖5）。

圖5 PRRSV－dGP5蛋白的Western blot檢測Fig.5Western blot detection of PRRSV－dGP5

3 討論

豬繁殖與呼吸綜合征在全世界范圍內(nèi)迅速的傳播，給整個養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，因此研制出有效的疫苗就顯得十分重要。本研究中成功得到了缺失了N端30個氨基酸殘基的GP5蛋白，這為該疫苗的研制提供了選擇的機會。有報道曾經(jīng)證實，感染PRRSV康復(fù)豬的血清中GP5蛋白的抗體滴度與中和病毒的能力具有顯著相關(guān)性［8］。可見，GP5蛋白可以在機體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體。但鮮有重組的GP5蛋白成功在體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體的報道，可能與A表位的存在，極大地延緩和減弱了B表位誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生有關(guān)［9］。本試驗成功擴增出了缺失A表位基因的dGP5基因片段，為進一步研究中和抗體的產(chǎn)生奠定了基礎(chǔ)。

PRRSV－GP5蛋白含有3個疏水跨膜區(qū)以及存在較多的大腸埃希菌稀有密碼子，這些因素都嚴重影響了其表達量［10］。在本試驗中，目的基因在表達載體pGEX－6P－1中的表達量并不高，證實了上述影響因素存在的可能性。另外，冷超糧等［11］研究結(jié)果表明，HP－PRRSV只有B表位并不能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，推測在中和抗體產(chǎn)生的過程中，GP5基因中B表位之外的其他基因片段可能發(fā)揮了重要作用。因此本研究僅對N端信號肽序列以及A表位基因這一覆蓋表位進行了敲除，而保留了包括B表位基因在內(nèi)的大部分GP5基因，并在大腸埃希菌中成功表達了大小約40ku的GP5蛋白，經(jīng)Western blot分析表明，重組的GP5蛋白能夠和PRRSV陽性血清反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性。然而，該融合蛋白能否較早激發(fā)較強的中和抗體值得進一步深入探究。

［1］Wensvoort G，Terpstra C，Pol J M A，et al.Mystery swine disease in the Netherlands：The isolation of Lelystad virus［J］.Vet Microbiol，1991，13（3）：121－130.

［2］Snijder E J，Meulenberg J M.The molecular biology of arteriviruses［J］.J Gen Virol，1998，271：4684－4691.

［3］周海范，夏平安，崔保安，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒河南分離株ORF5基因的克隆與變異分析［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2007，27（6）：111－113.

［4］谷 紅，楊漢春，郭 鑫，等.PRRSV BJ－4株ORF5基因的原核表達與重組蛋白的純化［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2004，35（1）：64－69.

［5］陳軍義，王開功，羅險峰，等.PRRSV GZJL株GP5基因的克隆及原核表達［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，34（1）：101－104.

［6］Oleksiewicz M B，Botner A .Porcine B－cells recognize epitopes that are porcine reproductive and conserved between the structural of American－and European－type respiratory syndrome virus［J］.J GenViro1，2002，83（6）：1407－1418.

［7］顧小雪，李玉峰，姜 平，等.豬生殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白抗原表位基因的表達及其表達產(chǎn)物的抗原性［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2007，37（12）：1053－1057.

［8］王云峰，周艷君，仇華吉，等.應(yīng)用重組N蛋白－ELISA檢測豬繁殖與呼吸綜合征抗體的研究［J］.中國獸醫(yī)雜志，2001，37（3）：3－5.

［9］劉 濤，陳賽娟，曹洪站，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒 HB－3（cz）株ORF5基因序列分析及原核表達［J］.中國獸醫(yī)雜志，2008，44（12）：88－91.

［10］Ostvowslti M，Galeota J A，Jar A M，et al.Identification of neutralizing and nonneutralizing epitopes in the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5ectodomain［J］.2002，76（9）：4241－4250.

［11］冷超糧，安同慶，陳家锃，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白B表位誘導(dǎo)中和抗體能力的研究［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2011，33（4）：297－300.