吳寧玲 吳沂旎 莊曾淵 郭曉勤

近年來研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞是重要的內(nèi)分泌細(xì)胞，可分泌多種活性物質(zhì)參與血管舒展和緊縮調(diào)節(jié)的體液調(diào)節(jié)機(jī)制。視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（retina vascular endothelial cells，RVECs）為血－視網(wǎng)膜屏障的內(nèi)屏障，RVECs損傷會(huì)導(dǎo)致血－視網(wǎng)膜屏障受損及血管舒展和緊縮調(diào)節(jié)的活性物質(zhì)分泌紊亂，加快許多眼部疾病（如糖尿病性視網(wǎng)膜病變、黃斑變性、高度近視等）的發(fā)展，因此研究保護(hù)RVECs是防治這類疾病的新途徑。

銀杏葉，又名白果樹葉，為銀杏科植物銀杏樹的干燥葉。《本草綱目》記載其性味甘苦而澀，入肺、腎經(jīng)。它有定喘、止咳、止帶濁、縮小便等作用。銀杏葉提取物（extract of ginkgo biloba，EGB）是采用現(xiàn)代提取技術(shù)從銀杏葉中提取的活性物質(zhì)，其有效成分主要是黃酮甙類和萜內(nèi)酯類化合物。銀杏葉提取物具有改善血液流變學(xué)狀況、抑制血小板聚集、抗氧化、清除自由基、緩解缺血缺氧及舒張血管平滑肌等有益作用。本文就EGB對缺氧狀態(tài)下RVECs增殖的影響進(jìn)行了系統(tǒng)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（購自北京中日友好醫(yī)院臨床研究所）。（2）試劑和儀器：DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），美國 Gibco公司產(chǎn)品；胰酶、甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞楓，美國 Sigma 公司產(chǎn)品；內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（endothelial cell growth factor，ECGF），購自北京中日友好醫(yī)院臨床研究所；銀杏葉提取物標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品產(chǎn)檢定所產(chǎn)品，批號：110866-200803）。 ELX808 酶標(biāo)儀，美國 Bio-Tek公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

將購買的牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)蘇，用含200 g/L FBS、100 mg/L ECGF、100mg/L 肝素以及 100×103U·L-1雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基接種于20g·L-1明膠包被的培養(yǎng)瓶，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱培養(yǎng)。以后每4~5 d換液1次直至長成單層細(xì)胞。選第7代內(nèi)皮細(xì)胞，0.1%胰蛋白酶消化備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為5組，即（1）空白對照組：無血清、無生長因子的DMEM培養(yǎng)液；（2）缺氧組：細(xì)胞對照組＋終濃度 1 mmol/ml CoCl2；（3）EGB 低濃度組：缺氧組＋0.001 μg/ml銀杏葉提取物；（4）EGB 中濃度組：缺氧組＋0.01 μg/ml銀杏葉提取物；（5）EGB 高濃度組：缺氧組＋0.1 μg/ml銀杏葉提取物。

1.4 MTT比色實(shí)驗(yàn)檢測RVECs增殖情況

將血管內(nèi)皮細(xì)胞以3×104個(gè)/ml濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μl，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，用含20%胎牛血清及100 μg/ml生長因子的培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)分組將CoCl2和含不同濃度EGB的培養(yǎng)基分別與RVECs繼續(xù)培養(yǎng)24 h及 48 h后，96孔板每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），繼續(xù)孵育 4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清培養(yǎng)液，每孔再加入150 μl DMSO，打勻振蕩5 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇492 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS for Windows（17.0版）統(tǒng)計(jì)軟件對計(jì)量資料進(jìn)行方差分析，用Least-significant-difference（LSD）法進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)24 h，可見約30%～40%RVECs已貼壁，呈三角形或短梭形，排列不規(guī)則，核淡，胞膜明顯（圖 1），3～4 d后成片融合，細(xì)胞緊密排列，互不重疊，呈典型的鋪路卵石樣結(jié)構(gòu)。傳代細(xì)胞約4～5 d能鋪滿培養(yǎng)瓶底。缺氧組的細(xì)胞貼壁率明顯減少，呈凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變（圖2）。EGB組細(xì)胞貼壁率增加，凋亡細(xì)胞減少（圖3）。

2.2 不同濃度銀杏葉提取物對缺氧狀態(tài)下RVECs增殖的影響

EGB低、中、高濃度組各時(shí)間點(diǎn)的光密度值均高于缺氧組（P<0.05）。分組培養(yǎng)24 h，EGB高濃度組（0.1 μg/ml）的增殖活性最高；培養(yǎng) 48 h，EGB 中濃度組（0.01 μg/ml）的增殖活性最高，EGB 高濃度組的細(xì)胞增殖減緩（表1）。

3 討論

MTT可以將活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物，使沉積在細(xì)胞中，通過使用DMSO溶解細(xì)胞中的藍(lán)紫色結(jié)晶物，并用自動(dòng)酶標(biāo)儀在492 nm波長處測定其吸光度值，即可間接反應(yīng)活細(xì)胞數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞為觀察對象，以MTT法檢測RVECs在不同濃度銀杏葉提取物作用下的增殖活性。

實(shí)驗(yàn)性缺氧方法有2種，一種是在低氧環(huán)境中培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞或組織，也稱為環(huán)境缺氧；另一種是在細(xì)胞或組織培養(yǎng)液中加入鐵的螯合劑或CoCl2，阻斷氧信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細(xì)胞中模擬低氧信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，也稱為細(xì)胞缺氧。環(huán)境缺氧方法由于需要特殊的培養(yǎng)設(shè)備和低氧濃度的混合氣體，限制了其在實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。Co2+是鐵螯合酶的底物，可以取代血紅蛋白卟啉環(huán)中的Fe2+，但是Co2+對氧的親和力較低，使血紅蛋白不能與氧結(jié)合，而保持還原構(gòu)象，這樣就模擬了缺氧狀態(tài)。CoCl2的作用機(jī)理與低氧一致，相當(dāng)于細(xì)胞氧感受器受到低氧刺激，本實(shí)驗(yàn)采用CoCl2成功模擬了內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧環(huán)境〔1-2〕。

表1 MTT法測定各組牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性［D（492 nm），±s］

表1 MTT法測定各組牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性［D（492 nm），±s］

注：與缺氧組比較，①P＜0.05（方差分析，LSD 法）。 EGB：銀杏葉提取物

不同培養(yǎng)時(shí)間的光密度值24 h 48 h空白對照組 0.225±0.01① 0.257±0.01①缺氧組 0.193±0.01 0.184±0.01 EGB 低濃度組 0.001 0.214±0.02① 0.260±0.01①EGB 中濃度組 0.01 0.224±0.01① 0.283±0.02①EGB 高濃度組 0.1 0.230±0.02① 0.248±0.01①F值 61.79 29.22 P值 0.000 0.000組別 EGB質(zhì)量濃度/（μg/ml）

國內(nèi)外學(xué)者自20世紀(jì)60年代開始對銀杏葉的化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用做了大量的研究工作。研究表明，銀杏葉提取物中含有的內(nèi)酯成分能明顯地?cái)U(kuò)張血管，尤其是擴(kuò)張微循環(huán)〔3〕。一項(xiàng)對正常受試者的對比研究發(fā)現(xiàn)，口服銀杏葉提取物可使眼動(dòng)脈血流量增加 24%〔4〕。Kristinsson 等[5]的研究也發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物可增加視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的血液供應(yīng)，并改善視功能。季梅等〔6〕研究證明銀杏黃酮具有抗氧化作用，通過保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞松弛因子的釋放而調(diào)節(jié)血管舒縮功能，擴(kuò)張血管，增加缺血區(qū)血流量，從而改善視網(wǎng)膜末梢循環(huán)，以利阻塞血管再通〔7〕。因此目前銀杏葉提取物在眼科主要用于眼部缺血性疾病如視網(wǎng)膜靜脈阻塞、缺血性視神經(jīng)病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變等。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，24 h及48 h缺氧組的光密度值均低于細(xì)胞對照組，3個(gè)濃度銀杏葉提取物組光密度值均高于缺氧組（P<0.05），并且在一定濃度范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的增加而增加，說明銀杏葉提取物對缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，適宜濃度的銀杏葉提取物對缺氧狀態(tài)下的RVECs增殖呈明顯促進(jìn)作用。

目前發(fā)現(xiàn)RVECs及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞耗氧量大，對缺血缺氧最敏感，如在糖尿病視網(wǎng)膜病變早期，RVECs及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和分泌功能就發(fā)生改變，促使視網(wǎng)膜血管基底膜增厚、血管內(nèi)外氧交換障礙，使視網(wǎng)膜內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）增加，破壞血－視網(wǎng)膜屏障，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管形成。有類似發(fā)病機(jī)制的眼病很多，其他如視網(wǎng)膜靜脈阻塞、黃斑變性、高度近視視網(wǎng)膜病變等。本研究提示銀杏葉提取物對RVECs有保護(hù)作用，也許在一定程度上能阻斷RVECs受損這一始動(dòng)環(huán)節(jié)，從而減輕血－視網(wǎng)膜屏障的破壞，保持血管舒展和緊縮調(diào)節(jié)的活性物質(zhì)的平衡，為治療這類疾病提供一個(gè)新的途徑。至于EGB對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用的具體機(jī)理，尚有待進(jìn)一步地研究。

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