劉曉娟 姜海濤 尹莉莉 吳星偉 顧 青

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular de generation，AMD）是發(fā)達(dá)國家50歲以上人群致盲的首要原因。目前認(rèn)為視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞的氧化應(yīng)激與干性AMD發(fā)病密切相關(guān)，而氧化應(yīng)激能夠誘導(dǎo)或加速細(xì)胞衰老的發(fā)生。因此，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞衰老模型是研究此類疾病發(fā)病機(jī)制和治療方法的一個切入點。目前干性AMD病因并未完全明了，迄今為止未有明確有效的治療方法來提高視力或防止視力惡化，也無有效的預(yù)防措施。本實驗中靈杞黃斑顆粒（Lingqi Huangban Granula，LQHB）是我們自制的復(fù)方中藥顆粒沖劑〔1〕，已應(yīng)用于臨床十多年，主要用于年齡相關(guān)性黃斑變性以及其他各類視網(wǎng)膜變性類疾病。本實驗采用血清藥理學(xué)方法〔2〕，通過探討中藥LQHB含藥血清預(yù)處理對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞衰老損傷的保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用提供客觀實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株（ARPE l9，美國），將凍存的RPE細(xì)胞株，通過復(fù)蘇、接種、培養(yǎng)、消化后，獲得單細(xì)胞懸液備用。30%H2O2（上海虹光化工廠），DMEM培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基、10%胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素（上述均購自美國GIBCO公司）、MTS（Promega 公司）、DMSO（分析純）、細(xì)胞周期檢測試劑盒和細(xì)胞衰老檢測試劑盒（碧云天公司）。高速冷凍離心機(jī)（Zentmifugen Hettich 公司）、Eppendorf管（Eppendorf公司）、4 ℃冰箱（青島海爾公司）、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Sanyo公司）、細(xì)胞培養(yǎng)板（Nunc公司）、DK-8A型電熱恒溫水槽（上海森信實驗儀器有限公司）、超潔凈工作臺（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、流式細(xì)胞儀（Pharmacia Biotech公司）、分光光度儀（HACH，USA）。實驗動物雄性SD大鼠24只，清潔級，體重220～230 g，購于中國科學(xué)院上海實驗動物中心。動物合格證號：SCXK（滬）2008-0016。LQHB（滬藥制字Z05050795，上海市藥監(jiān)局醫(yī)院制劑認(rèn)證。生產(chǎn)批號：20100101，上海練塘中藥廠生產(chǎn)，規(guī)格15 g/包，含生藥53 g／包。主要組成（質(zhì)量比例）：當(dāng)歸10份、川芎10份、菟絲子10份、靈芝10份、蒼術(shù)10份、丹參10份、黨參10份、海藻10份、肉蓯蓉15份、枸杞子l0份。

實驗動物購回后于實驗動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)，自由攝水飲食，籠養(yǎng)。24只SD大鼠隨機(jī)分成中藥血清組（16只）和空白血清組（8只），中藥血清組又分為低劑量組和高劑量組，每組8只。采用灌胃方式給藥，依據(jù)動物與人體的每千克體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表，每次低劑量組和高劑量組的給藥劑量分別為3.125 g/kg 和 6.25g/kg，分 2 次給藥（8 時，20 時），連續(xù) 3d〔3〕?？瞻籽褰M予以同等量生理鹽水灌胃。末次喂藥前禁食12 h，灌藥后1~2 h內(nèi)無菌條件下腹主動脈取血?？瞻籽褰M同一時間點取血。取血后4℃冰箱中靜置過夜，3000 r/min，25 min離心，取上清液并將同組別的不同大鼠血清混合。經(jīng)56℃，30 min滅活分裝，并于超凈臺內(nèi)0.22 μm針式濾過器過濾分裝，-20℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 MTS法檢測細(xì)胞活力

1.2.1 細(xì)胞制備：將RPE細(xì)胞以2.5×104個/ml的密度接種于96孔板，每孔100 μl，加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)80%～90%后取出。

1.2.2 分組培養(yǎng)：（1）棄上清液，PBS沖洗2次后分5組：分別為正常對照組（normal control，NC）、模型組（model，M）、空白血清組（model+Blank serum group,MB）以及低劑量含藥血清組（model+low-dose LQHB group，ML）、高劑量含藥血清組（model+high-dose LQHB group，MH），各組均加入無血清 DMEM/F12培養(yǎng)液，血清組分別加入含10%的制備空白血清，低、高劑量含藥血清，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出。（2）棄上清液，PBS沖洗2次后分別于模型組，空白血清組，低、高劑量含藥血清組4組每孔加入 H2O2，使 H2O2終濃度為 150 μmol／L，繼續(xù)置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。（3）棄上清液，PBS沖洗2次后加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 MTS法檢測：將20μl MTS直接加入培養(yǎng)板孔的培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。搖床上放置5 min，490 nm分光光度儀上機(jī)檢測。每組6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

1.3.1 細(xì)胞制備：將RPE細(xì)胞以1×106個/ml密度接種于培養(yǎng)皿，加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)80%～90%后取出。

1.3.2 分組培養(yǎng)：棄上清液，PBS沖洗2次后分組，步驟方法同1.2.2。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測：用0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，按照細(xì)胞周期檢測試劑盒說明操作。上流式細(xì)胞儀檢測。應(yīng)用Cell Quest軟件包中的Modifit LT 2.0軟件處理，進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.4 細(xì)胞衰老的檢測

1.4.1 細(xì)胞制備：將RPE細(xì)胞以8×104個/ml密度接種于置有小玻片的24孔板，加入含10%FBS的DMEM/F12 培養(yǎng)液 500 μl置于 37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)70%～80%后取出。

1.4.2 分組培養(yǎng)：棄上清液，PBS沖洗2次后分組，步驟方法同1.2.2。

1.4.3 細(xì)胞衰老檢測：（1）棄上清液，PBS洗滌3 min×3遍，按照碧云天細(xì)胞衰老檢測試劑盒說明書操作。（2）37℃濕盒內(nèi)孵育過夜后用伊紅套染未著色細(xì)胞胞漿，普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，在顯微鏡（×400倍）下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，隨機(jī)選取陽性細(xì)胞分布均勻的區(qū)域，每組檢查10個視野，每個視野數(shù)出總細(xì)胞數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)，計算出陽性細(xì)胞的百分比，即為衰老細(xì)胞百分率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 LQHB含藥血清對RPE細(xì)胞活力的影響

高、低劑量LQHB含藥血清組的光密度值低于正常對照組，高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而空白血清組與模型組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表 1）。

表1 MTS法測定各組RPE細(xì)胞的光密度值[D（492nm），±s]

表1 MTS法測定各組RPE細(xì)胞的光密度值[D（492nm），±s]

注：與正常對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P＞0.05，③P<0.05；與低劑量組比較，④P＞0.05。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義（方差分析并做SNK-q檢驗）

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2.2 LQHB含藥血清對RPE細(xì)胞周期的影響

高、低劑量LQHB含藥血清組處于G1期的RPE細(xì)胞比例低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而空白血清組與模型組之間無顯著性差異（P>0.05）（表 2）。

表2 流式細(xì)胞儀檢測各組RPE細(xì)胞G1期構(gòu)成比例（±s，%）

表2 流式細(xì)胞儀檢測各組RPE細(xì)胞G1期構(gòu)成比例（±s，%）

注：與正常對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P＞0.05，③P<0.05；與低劑量組比較，④P＞0.05。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義（方差分析并做SNK-q檢驗）

組別 樣本數(shù) G1期比例正常對照組 100 81.83±2.05模型組 100 88.23±1.92①空白血清組 100 87.44±1.22①②低劑量含藥血清組 100 83.63±0.84③高劑量含藥血清組 100 84.52±1.03③④

2.3 細(xì)胞衰老的檢測[衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色]

高、低劑量LQHB含藥血清組衰老細(xì)胞所占比例均較模型組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而空白血清組與模型組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表 3）。

表3 SA-β-Gal染色法檢測各組衰老RPE細(xì)胞的比例（±s，%）

表3 SA-β-Gal染色法檢測各組衰老RPE細(xì)胞的比例（±s，%）

注：與正常對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P＞0.05，③P<0.05；與低劑量組比較，④P＞0.05。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義（方差分析并做SNK-q檢驗）。SA-β-Gal：衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶

組別 樣本數(shù) 衰老細(xì)胞比例正常對照組 100 5.54±0.84模型組 100 70.64±2.23①空白血清組 100 68.94±1.32①②低劑量含藥血清組 100 46.53±1.56③高劑量含藥血清組 100 41.09±1.03③④

3 討論

AMD是以RPE細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）堆積引起的以Bruch’s膜增厚為特征的一類疾病。雖然其視力損害的原因在于光感受器功能失調(diào)，但發(fā)病卻始于RPE細(xì)胞的衰老。通過外源性加入H2O2誘導(dǎo)是目前較公認(rèn)和成熟的研究細(xì)胞衰老的一種方法〔4-6〕。盡管干性AMD的發(fā)病率高，對視力影響嚴(yán)重，但可以得到治療的患者卻很有限。祖國醫(yī)學(xué)在治療干性AMD方面進(jìn)行了積極的探索，研究證實一些中藥單體和復(fù)方治療干性AMD取得了一定的療效，顯示了中醫(yī)藥治療的獨特優(yōu)勢。LQHB已在我院眼科15年臨床應(yīng)用中取得較好療效，前期實驗研究發(fā)現(xiàn)：LQHB能夠明顯減輕光損傷引起的大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷〔7〕；對缺氧引起的RPE細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用〔8〕；能夠抑制光損傷引起的感光細(xì)胞凋亡和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生；改善ERG的b波與振蕩電位（OPs）振幅及潛伏期，提示LQHB具有抗氧化作用，能夠通過改善視網(wǎng)膜神經(jīng)組織細(xì)胞的生物循環(huán)與代謝而緩解病情，展現(xiàn)了對干性AMD良好的治療前景〔9〕。

研究認(rèn)為衰老的RPE細(xì)胞具有如下特征：包括細(xì)胞肥大，衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶活性增高，細(xì)胞生長停止以及細(xì)胞周期停滯在G1期〔10-11〕。細(xì)胞衰老最顯著的特征是細(xì)胞在很長一段時間內(nèi)仍然維持代謝活性，但因阻滯于G1期，失去了對有絲分裂原的反應(yīng)能力和合成DNA的能力，不能進(jìn)入S期，本實驗驗證了這一點，并發(fā)現(xiàn)LQHB含藥血清預(yù)處理能夠減緩其衰老。SA-β-Gal染色活性檢測以X-Gal為底物，在衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化下會生成深藍(lán)色產(chǎn)物，從而在光學(xué)顯微鏡下很容易觀察到變成藍(lán)色的表達(dá)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞或組織。在本實驗中LQHB含藥血清組著色呈藍(lán)色的衰老RPE細(xì)胞比例遠(yuǎn)少于模型組（70%）?？瞻籽褰M的各項檢測結(jié)果與模型組無明顯差異，而高、低劑量組間各結(jié)果比較亦無統(tǒng)計學(xué)意義的差異，其原因有待進(jìn)一步研究。

本文初步闡明了靈杞黃斑顆粒含藥血清預(yù)處理對人RPE細(xì)胞衰老損傷的保護(hù)作用，其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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