楊積順 徐立平

(解放軍第100醫(yī)院藥械科，215007)

銀屑病是常見的慢性復(fù)發(fā)性皮膚病，其發(fā)病機(jī)制仍不清楚?；蛐酒址Q基因微陣列，是將大量的靶基因DNA片段以及不同長度的寡核苷酸高密度、有序地排列在硅片及合金片等固相物質(zhì)上。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)圖譜分析、腫瘤分子分型、基因診斷、基因突變、新藥研發(fā)等方面，且具有背景噪音低、重復(fù)性好、系統(tǒng)誤差小等優(yōu)點。銀屑病發(fā)病機(jī)制中的重要相關(guān)基因還有待進(jìn)一步的明確，因此，本研究采用現(xiàn)代基因芯片技術(shù)，通過使用隨機(jī)方差模型，篩選出銀屑病病人及健康人皮膚中顯著性差異基因，試為揭示銀屑病發(fā)病機(jī)制及藥物研究提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 皮膚組織來源 銀屑病病人皮損組織3例，來源于皮膚科門診，年齡(32.25±4.36)歲，部位為病人腹部皮膚；健康人皮膚組織3例，來源于醫(yī)院整形科門診，年齡(37.34±4.16)歲，取材部位為腹部皮膚。銀屑病皮膚樣本由病理科組織病理學(xué)確認(rèn)，3例銀屑病病人入組前均未患其他皮膚性疾病，且未進(jìn)行過局部或系統(tǒng)性藥物治療。所有參加本研究的志愿者均簽署知情同意書。

1.2 試劑 總RNA抽提采用Invitrogen公司的試劑盒；無RNA酶的糖原(Invitrogen公司)；cRNA標(biāo)記與合成采用TrueLabeling-AMPTM線性RNA擴(kuò)增試劑盒和SuperArray Array-Grade cRNA 純 化 試 劑 盒(貨 號 ：GA-012)；Biotin-16-dUTP(Roche Cat.No.1-093-070)；GEAhyb雜交液 (SuperArray Bioscience)；化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒Chemiluminescent Detection Kit(SuperArray Bioscience，Catalog Number D-01)，異丙醇、氯仿、無水乙醇等均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 總RNA的提取 以健康組皮膚樣本為對照，每100 mg銀屑病組與健康組皮膚樣品，采用Invitrogen公司的TRIZOL試劑一步法抽提皮膚樣品的總RNA，取少量液體用TE(10 mM Tris-HCl pH 8，1 mM EDTA)稀釋(1∶100稀釋)后，采用紫外吸收測定方法，讀取其在分光光度計260 nm和280 nm處的吸收值，采用變性瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射光下觀察并拍照28S和18S核糖體RNA的條帶，定量分析檢測RNA的質(zhì)量，A260/A280在1.8～2.0之間，且前者的條帶約是后者條帶的2倍。

1.3.2 Affmetrix表達(dá)譜芯片實驗與數(shù)據(jù)分析 芯片的雜交在Oligo GEArray芯片雜交管中進(jìn)行，采用預(yù)熱GEAhyb雜交液對生物素標(biāo)記的cRNA樣品進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。芯片的化學(xué)發(fā)光檢測按照SuperArray公司提供的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒操作步驟進(jìn)行。通過X膠片和臺式掃描儀獲得芯片圖像采集。使用綜合型GEArray表達(dá)分析配套軟件進(jìn)行完整的芯片數(shù)據(jù)分析，從而獲得銀屑病組和健康組的差異基因。同時進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得每條基因的名稱及其基本生物學(xué)信息。利用Cluster 3.0軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 將病理組織確認(rèn)為銀屑病的皮損，同時按照RNA質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，將RNA質(zhì)量合格者納入基因芯片實驗。

2.2 銀屑病基因表達(dá)差異(表1) Ratio值分析：對銀屑病組和正常對照組芯片中每張芯片上的所有基因的比值Ratio進(jìn)行分析，得出銀屑病組和正常組間存在差異表達(dá)基因共105條。其中表達(dá)上調(diào)(Ratio值大于2)的有47條，表達(dá)水平下調(diào)(Ratio值小于0.5)的有58條。經(jīng)檢索基因表達(dá)公共數(shù)據(jù)庫，獲得每條基因的名稱和其他基本信息表，其中表達(dá)上調(diào)幅度最大的基因為ABCC1，表1中列出若干銀屑病差異表達(dá)基因。

表1 銀屑病差異基因表達(dá)

3 討論

隨著對銀屑病發(fā)病機(jī)制認(rèn)識的不斷深入，我們對銀屑病的認(rèn)識較過去有了長足的進(jìn)步，但至今仍不知道銀屑病發(fā)病機(jī)制中涉及的重要功能基因是如何發(fā)揮功能的，或者說它們是如何按照特定的時間、空間進(jìn)行基因表達(dá)的，表達(dá)的量是多少，基因之間的調(diào)控關(guān)系是怎么樣。基因芯片是在核酸層次上研究基因表達(dá)的最新技術(shù)之一，可以大規(guī)模的對基因表達(dá)的個體特異性、組織特異性、發(fā)育階段的特異性、分化階段特異性、疾病特異性等進(jìn)行綜合分析和判斷，基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，對極其復(fù)雜的生命現(xiàn)象及疾病研究提供了一種高通量、大規(guī)模、高度并行性、快速高效、高度靈敏、蘊(yùn)藏高價值以及高度自動化的方法。銀屑病發(fā)病病因復(fù)雜，通過基因芯片技術(shù)挖掘到有趣的靶基因以及銀屑病的易感性基因位點，對更好地了解銀屑病的復(fù)雜的病因，發(fā)現(xiàn)新的銀屑病的治療靶點提供捷徑。Mee JB等[1]利用基因芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)銀屑病與IL-1轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān)。本研究中ABCC1基因在銀屑病中表達(dá)上調(diào)，可能與銀屑病發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，其為ATP結(jié)合盒(ABC)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ABCC1是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員，通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)藥物排出、改變藥物在細(xì)胞內(nèi)分布。這些跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠利用ATP水解釋放能量而實現(xiàn)底物分子在胞膜內(nèi)外的逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)[2]。夏天保等對60例銀屑病患者及60例健康對照者,分別用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)及測序分析基因組DNA的突變等位基因，結(jié)果證實銀屑病組血小板活化因子乙酰水解酶基因突變率(Ala379Val)與健康人群差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)[3]。銀屑病是一種表皮過度增生且炎性浸潤較為嚴(yán)重的反復(fù)復(fù)發(fā)的皮膚病，我們推測過度的表皮增生可能與機(jī)體皮膚細(xì)胞的能量代謝有關(guān)。該基因如何在銀屑病發(fā)病機(jī)制中傳導(dǎo)通路仍需后續(xù)的實驗研究。對銀屑病的基因?qū)W研究也有助于揭示臨床療效確切的藥物的可能作用機(jī)制。楊積順等研究發(fā)現(xiàn)芥子氣可抑制真皮成纖維細(xì)胞的增生,誘導(dǎo)其凋亡,該效應(yīng)可能與芥子氣促進(jìn)TRAILR1的表達(dá)有關(guān)[4]。同時對其誘導(dǎo)分泌TRAIL因子的時效和量效關(guān)系進(jìn)行了深入探討[5]。在本研究中，我們本次的研究結(jié)果從基因組學(xué)的角度反映出銀屑病患者與健康人之間存在著差異表達(dá)基因，從差異值比較中可以找出銀屑病患者的標(biāo)志基因，從而可以為銀屑病靶點藥物的研究提供理論基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步尋找銀屑病的生物標(biāo)志物提供科學(xué)依據(jù)。

[1]Mee JB，Johnson CM，Morar N，et al.The psoriatic transcriptome closely resembles that induced by interleukin-1 in cultured keratinocytes:dominance of innate immune responses in psoriasis[J].Am J Pathol JT-The American journal of pathology，2007，171(1)：32-42.

[2]Dean M，Rzhetsky A，Allikmets R.The human ATP-binding cassette(ABC)transporter superfamily.Genome Res，2001，11(7)：1156-66.

[3]夏天保，呂世超，畢新嶺，等.PAF-AH基因突變與銀屑病的相關(guān)性研究[J].中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2008，24(9)：686-89.

[4]楊積順，胡晉紅，朱全剛，等.芥子氣誘導(dǎo)人真皮成纖維細(xì)胞的凋亡研究[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2009，9(3)：178-181.

[5]楊積順，徐立平，胡晉紅.芥子氣誘導(dǎo)真皮成纖維細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的時效和量效研究[J].中國藥業(yè)，2012，21(6)：29-30.