張亞紅，米亞嫻，高立勤，吳 燕，袁雯瑋

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

妥布霉素是黑暗鏈霉菌(Streptomyces tenebrarius)發(fā)酵液中提取得到的具有廣譜抗菌活性的氨基糖苷類抗生素，對革蘭陽性菌和陰性菌均有良好的抗菌作用，尤其對銅綠假單孢菌感染具有高效的抗菌作用。據(jù)文獻報道[1]，該鏈霉菌發(fā)酵液中除妥布霉素外，尚存在含量不等的10多種其他氨基糖苷組分，且這些組分理化性質與妥布霉素近似。由于該品種缺乏紫外吸收，為了嚴格控制產(chǎn)品質量，《美國藥典》31版采用TLC法測定有關物質，《英國藥典》2008和《歐洲藥典》6.0均采用高效液相色譜-脈沖電流檢測器法，楊茂俊[2]等采用柱前衍生化法測定這些氨基糖苷有關物質的含量。

衍生化法和TLC法操作煩瑣，實驗條件對結果影響較大，脈沖電流檢測器價格昂貴，國內不普及。近年來國內外陸續(xù)有文獻報道采用蒸發(fā)光散射檢測技術分析氨基糖苷類抗生素[3-5]。本文建立高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)法測定妥布霉素的有關物質，為該技術的進一步推廣和應用提供實驗基礎。

1 材料

島津HPLC高效液相色譜儀；Alltech ELSD 2000蒸發(fā)光散射檢測器；妥布霉素標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號0340-200002Z，每1 mg相當于880 U)；卡那霉素B標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號130548-200501)；暗霉胺標準品(某國外企業(yè)提供)；妥布霉素為國內A藥廠(編號為1#、2#、3#)、B藥廠(編號為4#、5#、6#)和C藥廠(編號為7#、8#、9#)提供。

2 方法與結果

2.1色譜條件 Phenomenex Gemeni色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以0.2 mol/L的三氟醋酸為流動相；流速：0.4 ml/min；柱溫：30 ℃；蒸發(fā)光散射檢測器條件：漂移管溫度：110 ℃；載氣流速：3.0 L/min；靈敏度Gain=1；撞擊器模式：off模式。進樣量：10 μl。

2.2系統(tǒng)適用性試驗 取妥布霉素標準品和卡那霉素B標準品適量，加水制成每1 ml中約含0.25 mg的混合對照溶液，照上述色譜條件進樣10 μl，記錄色譜圖，見圖1。妥布霉素峰與卡那霉素B峰能完全分離，分離度為1.61，妥布霉素峰的對稱因子為1.16 ，理論板數(shù)按妥布霉素峰計為11 744。

2.3溶液制備

2.3.1供試品溶液 取本品，用水溶解并定量稀釋成每1 ml中約含4 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.3.2對照溶液 精密量取供試品溶液適量，加水定量稀釋制成每1 ml中約含12 μg(0.3%)、24 μg(0.6%)和48 μg(1.2%) 的溶液，作為對照溶液(1)、(2)、(3)。

1.卡那霉素B 2.妥布霉素圖1 系統(tǒng)適用性試驗色譜圖

2.4線性關系及最低檢出限 取妥布霉素、暗霉胺、卡那霉素B對照品各約25 mg，置100 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取4、6、8、10和25 ml，分別置50 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為系列濃度線性溶液，精密量取線性溶液各10 μl，依“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，以對照溶液濃度的對數(shù)值與相應的峰面積的對數(shù)值計算回歸方程，結果線性范圍分別為：妥布霉素20～120 μg/ml、卡那霉素B 19.1～114.6 μg/ml、暗霉胺23.6～141.6 μg/ml，妥布霉素、暗霉胺和卡那霉素B的回歸方程及相關系數(shù)分別為Y=1.625 8X+0.973 5(r=0.999 7)、Y=1.621 2X+0.829 1(r=0.999 4)和Y=1.628 7X+0.760 5(r=0.997 1 )。以妥布霉素計，本方法最小檢出濃度為5.80 μg/ml。

2.5穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液在室溫分別放置0、1、2、4、6和8 h時，依“2.1”項下色譜條件進樣，測定并計算有關物質含量，結果表明：供試品溶液在室溫放置8 h內穩(wěn)定。見表1。

表1 供試品溶液室溫放置穩(wěn)定性測定結果

2.6樣品測定 精密量取對照溶液和供試品溶液各10 μl，依“2.1”項下色譜條件，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質峰，用回歸方程計算供試品中各雜質的含量。采用建立的HPLC-ELSD法測定三個廠家的妥布霉素，發(fā)現(xiàn)主要雜質為暗霉胺，其次為卡那霉素B，產(chǎn)品質量較高的樣品，單個雜質的含量在0.2%以下，氨基糖苷雜質總量不超過0.5%。樣品測定結果見表2。根據(jù)新霉胺、暗霉胺與卡那霉素B標準品分別測定得到的保留時間定位，供試品溶液色譜圖見圖2。

表2 樣品有關物質測定結果

1.新霉胺 2.暗霉胺 3.卡那霉素B 4.妥布霉素圖2 典型供試品溶液色譜圖

3 討論

3.1計算方法的選擇 蒸發(fā)光散射檢測器為質量型檢測器，其工作原理為散射光的對數(shù)響應值與組分質量的對數(shù)值呈線性關系，即供試品溶液濃度的對數(shù)值與相應峰面積的對數(shù)值呈線性，故不宜用單點的對照溶液峰面積作比較。只能通過自身對照線性回歸方程來計算有關物質的含量。

3.2校正因子的測定 在方法研究時，對妥布霉素以及已知雜質卡那霉素B、暗霉胺進行了校正因子的測定，濃度范圍分別為：妥布霉素20～120 μg/ml、卡那霉素B 19.1～114.6 μg/ml、暗霉胺23.6～141.6 μg/ml，暗霉胺與卡那霉素校正因子分別為0.997 2和1.008 1，因此本方法計算時可不加校正因子。

3.3對照溶液的選擇 試驗證明，不同pH值的供試品溶液經(jīng)HPLC分析，用蒸發(fā)光散射檢測器檢測時，其響應值有較大的差異。為保證結果的正確性，供試品溶液與對照溶液的pH值應一致。故本標準采用供試品溶液稀釋的自身對照法。

測定三個濃度(0.3%、0.6%和1.2%)和六個濃度(0.25%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%和3.0%)的自身對照溶液并進行線性回歸，用上述兩個回歸方程分別計算雜質含量，結果基本一致，考慮本方法為有關物質檢查，采用三個濃度的回歸方程法，足以滿足測定結果精度要求，故本方法規(guī)定用0.3%、0.6%和1.2%三個濃度作為自身對照溶液的三個濃度。

3.4分離度參照物的選擇 依據(jù)“2.1”項下色譜條件，對妥布霉素中可能存在的有關物質卡那霉素B、新霉胺及暗霉胺進行考察，結果出峰順序依次為新霉胺、暗霉胺、卡那霉素B和妥布霉素，卡那霉素B與妥布霉素保留時間最為接近，且卡那霉素B標準品容易獲得，故用來作為系統(tǒng)適用性試驗中測定分離度的參照物。

1 Koch K F,Merkel K E,O’Connor S C，etal.Structures of some of the minor aminoglycoside factors of the nebramycin fermentation. J Org Chem，1978，43:1207

2 楊茂俊，吳章秀.高效液相色譜法分析國產(chǎn)妥布霉素及有關物質.中國抗生素雜志，1996，21(s)：73

3 王明娟，胡昌勤，金少鴻.采用HPLC-ELSD法分析小諾米星及其有關物質.藥物分析雜志，2002，22(3)：205

4 王明娟，胡昌勤，金少鴻.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法分析慶大霉素C組分. 藥物分析雜志，2002，22(6)：461

5 Vogel R,DeFillipo K,Reif V.Determination of isepamicin sulfate and related compounds by high performance liquid chromatography using evaporative light scattering detection. J Pharm Biomed Anal,2001,24(3):405