韋艷娜，熊祺琰，劉茂軍，馮志新，吳敘蘇，楊莉莉，邵國青

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所·農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室·國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014;2.南京天邦生物科技有限公司，南京 211102)

豬支原體肺炎(Mycoplasma pneumoniae of swine，MPS)，又稱豬氣喘病或豬地方性肺炎(Enzootic pneumonia of swine，EPS)，是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的一種豬慢性呼吸道傳染病。測定支原體的顏色變化單位(color changing units，CCU)是定量研究支原體的實驗方法之一，其原理是支原體生長分解培養(yǎng)基中的糖產(chǎn)生酸，使培養(yǎng)基pH下降(由7.6降至6.8)，從而使培養(yǎng)基中的酚紅指示劑由紅色變?yōu)辄S色［1］。在對Mhp的大規(guī)模培養(yǎng)和疫苗生產(chǎn)中，常常需要測定培養(yǎng)物中菌體數(shù)，以確定最佳收獲時間，故CCU計數(shù)方法是測定支原體菌體滴度高低的一種常規(guī)方法。目前國內(nèi)外常用96孔板和離心管法進行CCU測定，也有少數(shù)用青霉素瓶進行CCU測定。鑒于CCU測定方法尚沒有統(tǒng)一的標準，本試驗從三種不同培養(yǎng)體系、不同容器、不同稀釋方法進行研究分析，從而觀察各種因素對CCU的測定是否產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基 豬肺炎支原體NJ株、KM2培養(yǎng)基［2］均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所提供。豬肺炎支原體NJ株復壯后，傳3代，再以1∶9比例接種做CCU試驗。

1.2 CCU的測定［3］取菌種以無菌操作法依次10 倍系列稀釋，稀釋度達到 10－1、10－2、10－3……10－10。再設(shè)KM2培養(yǎng)基作對照，置37℃恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。每日觀察記錄培養(yǎng)基顏色變化和混濁度的變化，對培養(yǎng)基顏色變黃的稀釋管，再進行瑞氏染色、鏡檢，觀察有無雜菌及菌體形態(tài)，直至15～20 d。并依上法重復3次，以驗證試驗的正確性。

1.3 不同培養(yǎng)體系對豬肺炎支原體NJ株CCU測定的影響 試驗采用2 mL離心管進行CCU測定，培養(yǎng)體系分別為 0.18、0.27、0.45、0.9 mL(表 1)，置37℃恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。CCU測定過程中用移液槍進行10倍稀釋。為了試驗的準確性，我們對每個容器進行3次重復試驗。

表1 不同培養(yǎng)體系所加菌液及培養(yǎng)基的量

1.4 不同容器對豬肺炎支原體NJ株CCU測定的影響 試驗采用7 mL青霉素瓶、2 mL離心管、96孔板進行CCU測定，置37℃恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。CCU測定過程中用移液槍進行10倍稀釋。為了試驗的準確性，對每個容器做3次重復試驗。各容器所加菌液和培養(yǎng)基的量見表2。

表2 不同容器所加菌液及培養(yǎng)基的量

1.5 不同稀釋方法對豬肺炎支原體NJ株CCU測定的影響 CCU測定用7 mL青霉素瓶，移液槍進行10倍稀釋，加入菌液和KM2的量分別為0.1 mL和0.9 mL。試驗分為兩組:(1)稀釋時，菌液原液吸出0.1 mL到第1管，換槍頭吹打稀釋后從第1管中吸出定量的混勻液打入第2管，立即換槍頭吹打稀釋后吸出等量的混勻液，再打入第3管，依次往下至第10管;(2)稀釋時，菌液原液吸出0.1 mL到第1管，吹打稀釋后換槍頭，從第1管中吸出定量的混勻液打入第2管吹打稀釋，換槍頭依次往下至第10管。置37℃恒溫箱內(nèi)靜止培養(yǎng)，為了試驗的準確性，對每種方法做3次重復試驗。

1.6 CCU的計算［4］為了使試驗結(jié)果更為準確，計算1 mL菌液中所含支原體的量為x×10yCCU/mL，x為0.1 mL與CCU測定時接種菌液的量的倍數(shù)，y為每次重復試驗達到變色孔數(shù)的平均值，最后換算為以10為底的冪，用 SPSS19軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)體系對豬肺炎支原體NJ株CCU測定的影響 通過培養(yǎng)體系分別為0.18、0.27、0.45、0.9 mL進行CCU測定，結(jié)果顯示，這4種不同的體系對CCU結(jié)果無影響(表3)，只是培養(yǎng)體系為0.9 mL 比培養(yǎng)體系為0.18 mL、0.27 mL 及0.45 mL 的CCU變色速度要快1～2 d。

表3 不同培養(yǎng)體系對豬肺炎支原體NJ株CCU測定比較

2.2 不同容器對豬肺炎支原體NJ株CCU測定的影響 三種不同容器對豬肺炎支原體NJ株CCU的測定結(jié)果顯示，青霉素瓶和EP管、青霉素瓶和96孔板、EP管和96孔板兩兩比較其CCU差異不顯著(P＞0.05)(表4)。由此可見，這三種容器對豬肺炎支原體NJ株CCU測定的影響不大，均可用于CCU含量的測定。

表4 不同容器對豬肺炎支原體NJ株CCU測定比較

2.3 不同稀釋方法對豬肺炎支原體NJ株CCU測定的影響 用青霉素瓶通過先稀釋后換槍頭和先換槍頭后稀釋這兩種不同的稀釋方法對豬肺炎支原體NJ株進行CCU測定，結(jié)果顯示，CCU差異不顯著(表5)。由此可見，這兩種稀釋方法對豬肺炎支原體NJ株CCU測定的影響都不大，均可用于CCU測定。

表5 不同稀釋方法對豬肺炎支原體NJ株CCU測定比較

3 討論

因支原體菌落較小，用CFU測定其含量較為困難，故支原體的CCU測定仍是測定支原體含量的經(jīng)典方法［5］，廣泛用于支原體的培養(yǎng)檢驗，活疫苗的保存條件檢測，各種佐劑或抗生素對支原體的影響試驗以及各種動物攻毒試驗等。本研究對這些領(lǐng)域的研究具有重要的參考價值。雖然沈青春等［6］用PCR方法測定豬肺炎支原體培養(yǎng)物菌數(shù)，Calus等［4］用ATP法比較了其與CCU的差異，發(fā)現(xiàn)ATP法有明顯的優(yōu)勢。但CCU計數(shù)方法仍比較直觀，其測定的是培養(yǎng)物中的活菌數(shù)，結(jié)果更具有代表性，特別是在檢驗疫苗的活菌數(shù)中具有不可替代的作用。

CCU測定對操作要求比較高，測定結(jié)果直接受到培養(yǎng)基、器皿潔凈度、操作中的人為因素等的影響。因此，本實驗從不同容器、不同稀釋方法、不同培養(yǎng)體系等因素對CCU測定進行了比較分析。結(jié)果顯示青霉素瓶、EP管和96孔板這三種容器對豬肺炎支原體NJ株CCU測定的影響不大，其結(jié)果與葉元康等［7］用微量測定法測定解脲支原體含量的試驗結(jié)果一致，說明這三種容器均可用于CCU含量的測定。此外先稀釋后換槍頭和先換槍頭后稀釋這兩種不同的稀釋方法進行豬肺炎支原體NJ株CCU的測定結(jié)果也沒有影響;不同培養(yǎng)體系對CCU測定也沒有明顯影響，只是培養(yǎng)體系多的比培養(yǎng)體系少的CCU變色速度快1～2 d。

［1］畢丁仁，王桂枝.動物霉形體及研究方法［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

［2］還紅華，邵國青，倪艷秀，等.豬肺炎支原體培養(yǎng)技術(shù)研究［J］.中國人獸共患病雜志，2001，17((3):70 －71.

［3］王繼春，邵國青，何家惠，等.豬肺炎支原體#168無細胞弱毒疫苗株的變色單位測定試驗［J］.畜牧與獸醫(yī)，2001，33(6):22.

［4］Calus D，Maes D，Vranckx K，et al.Validation of ATP luminometry for rapid and accurate titration of Mycoplasma hyopneumoniae in Friis medium and a comparison with the color changing units assay［J］.Journal of Microbiological Methods，2010，83:335 －340.

［5］Stemke G W，Robertson J A.Comparison of two methods for enumeration of Mycoplasmas［J］.Journal of Clinical Microbiology，1982，16(5):959 －961.

［6］沈青春，覃青松，王 琴，等.PCR方法測定豬肺炎支原體培養(yǎng)物菌數(shù)［J］.中國預防獸醫(yī)雜志，2006，28(1):55 －57.

［7］葉元康，林特夫，黃谷良.解脲支原體的微量菌落形成單位和顏色變化單位的測定［J］.蚌埠醫(yī)學院學報，1986，11(4):252－254.