高自召

(浙江賜富醫(yī)藥有限公司，浙江紹興 312030)

那西肽是一種含硫多肽類抗生素，英文名Nosiheptide，是一種比較理想的飼用抗生素?fù)Q代品。那西肽最先由羅納普朗克公司進(jìn)行研究和試生產(chǎn)，但由于其產(chǎn)量低，成本太高而未能大規(guī)模推廣。直到80年代，開(kāi)始規(guī)?；a(chǎn)。雖然之后通過(guò)育種及工藝優(yōu)化工作的持續(xù)開(kāi)展，其菌種水平有了很大的提高，但菌種產(chǎn)量尚存在很大的提升空間。那西肽主要由活躍鏈霉菌(Streptomyces actuosus)、抗生素鏈霉(S.antibiotics)和青灰色鏈霉菌(S.glaucogriseus)產(chǎn)生，其中以活躍鏈霉菌為最好［1］。在此，對(duì)那西肽產(chǎn)生菌出發(fā)菌株N106的孢子進(jìn)行抗鏈霉素致死劑量測(cè)定，采用紫外對(duì)出發(fā)菌株孢子進(jìn)行誘變處理，使誘變孢子的DNA產(chǎn)生高頻率突變，然后將突變的孢子涂布在含有鏈霉素最低抑制濃度的培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得鏈霉素抗性基因(str)突變高產(chǎn)菌株 NUS146、NUS182。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 那西肽產(chǎn)生菌N106菌株，本室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面和平板培養(yǎng)基:可溶性淀粉、牛肉膏、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸氫二鉀等，pH 7.2～7.4，去離子水配制。種子培養(yǎng)基:淀粉、黃豆餅粉、酵母粉、硫酸銨等，pH 7.2 ～7.4，飲用水配制。發(fā)酵培養(yǎng)基:淀粉、黃豆餅粉、硝酸鈉、硫酸鎂等，pH 7.0 ～7.5，飲用水配制。

1.1.3 硫酸鏈霉素 大連醫(yī)藥集團(tuán)大連制藥廠。

1.1.4 原料和試劑 玉米漿、玉米粉、玉米淀粉、黃豆餅粉、酵母粉等均購(gòu)自市場(chǎng)?？扇苄缘矸?分析純)、NaNO3(分析純)、MgSO4(分析純)、(NH4)2SO4(分析純)、K2HPO4(分析純)、N，N － 二甲基甲酰胺(分析純)、乙醇(分析純)等。

1.1.5 儀器 Waters高效液相色譜儀、生物效價(jià)測(cè)量?jī)x、搖床等。

1.2 方法

1.2.1 制備單孢子懸液 取N106菌株新鮮斜面，用無(wú)菌水制成孢子懸液，脫脂棉過(guò)濾，收集單孢子懸液，用血球計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為108/mL。

1.2.2 鏈霉素對(duì)N106菌株孢子的最低抑制濃度的測(cè)定 將制備好的出發(fā)菌株的孢子懸液涂布在含不同濃度(u/mL)鏈霉素的那西肽固體平板上，28℃下培養(yǎng)7 d，觀察平板上的菌落數(shù)，凡是在前一個(gè)低濃度平板上已長(zhǎng)出菌落，而在后一個(gè)較高濃度平板上未長(zhǎng)出菌落的，后一濃度即為抗生素對(duì)出發(fā)菌株的孢子的最低致死濃度，即最低抑制濃度［2］。此試驗(yàn)需要先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，大致確定鏈霉素最低抑制濃度范圍后，再進(jìn)行濃度范圍設(shè)置及正式試驗(yàn)，最終確定最低抑制濃度。每次試驗(yàn)條件應(yīng)保持一致，如每次涂布于鏈霉素平板上的孢子懸液中孢子數(shù)量應(yīng)保持在一個(gè)數(shù)量級(jí)。

1.2.3 紫外誘變最適劑量的確定 取5 mL濃度為108個(gè)/mL的孢子懸液于培養(yǎng)皿中，置紫外誘變箱(紫外燈功率15 W，253.7 nm，照射距離30 cm)中攪拌誘變，時(shí)間分別為 0(對(duì)照)、20、30、40、60、80、100 s，稀釋涂皿，28 ℃避光培養(yǎng)7 d。

1.2.4 鏈霉素抗性突變株的制備 將經(jīng)過(guò)紫外誘變的孢子懸液按0.1 mL/皿的加量涂布于含最小抑制濃度的鏈霉素培養(yǎng)基平板上，28℃避光培養(yǎng)7 d，生長(zhǎng)出的菌落即為鏈霉素抗性突變株。

1.2.5 抗性突變株的斜面制備 將單菌落接種于那西肽試管斜面培養(yǎng)基上，28℃避光培養(yǎng)7 d，保存于冷藏冰箱，待搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。

1.2.6 抗性突變株的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 斜面接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，28℃200 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)46～48 h，然后以5%的接種量接種到裝有50 mL發(fā)酵液的500 mL三角瓶中，28℃ 200 r/min，旋轉(zhuǎn)式搖床發(fā)酵160～168 h。

1.2.7 那西肽含量的測(cè)定 用生物效價(jià)檢測(cè)法進(jìn)行發(fā)酵液中那西肽含量檢測(cè)。

1.2.8 那西肽組分分析 使用Waters高效液相色譜儀對(duì)高產(chǎn)菌株與對(duì)照出發(fā)菌株發(fā)酵液進(jìn)行那西肽組分分析，以確定高產(chǎn)菌株產(chǎn)生的抗生素成分。HPLC色譜條件:250 mm×4.6 mm C18反相柱，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min，流動(dòng)相為乙腈(含 0.1%TFA)、水(含 0.025% 磷酸)(50∶50)。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品溶液制備:那西肽標(biāo)準(zhǔn)品用DMF溶解，配成1000 u/mL溶液;高產(chǎn)菌株發(fā)酵液用DMF浸提，浸提完成后取濾液用DMF稀釋成約含那西肽1000 u/mL的溶液。

1.2.9 抗性突變株的穩(wěn)定性研究 通過(guò)菌株傳代，檢測(cè)不同代數(shù)菌株的發(fā)酵目標(biāo)代謝產(chǎn)物含量有無(wú)明顯變化，以判斷突變菌株的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈霉素最低抑制濃度的測(cè)定 預(yù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)6個(gè)鏈霉素梯度濃度，分別為 0、0.5、1、5、10、50 u/mL，結(jié)果在鏈霉素濃度為5～50 u/mL的培養(yǎng)基上未長(zhǎng)菌落。由此可知，鏈霉素對(duì)那西肽出發(fā)菌種N106的最小致死濃度小于5 u/mL。據(jù)此，將0～5 u/mL 再細(xì)分為0.5、1、2、3、4、5 共 6 個(gè)鏈霉素梯度濃度再次進(jìn)行試驗(yàn)。兩次試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 那西肽產(chǎn)生菌在不同濃度鏈霉素平板上的致死率統(tǒng)計(jì)表

由表1可知，那西肽產(chǎn)生菌出發(fā)菌株對(duì)鏈霉素極度敏感，低劑量的鏈霉素就能使死亡率達(dá)到90%以上。隨著鏈霉素濃度的增加，出發(fā)菌株在篩選平板上的單菌落逐漸減少，當(dāng)鏈霉素濃度為1 u/mL時(shí)，菌落生長(zhǎng)就受到很大影響，生長(zhǎng)變慢，明顯小于對(duì)照，并出現(xiàn)一些全禿或半禿的菌落。當(dāng)鏈霉素濃度達(dá)到3 u/mL時(shí)，篩選平板上無(wú)單菌落形成，故鏈霉素對(duì)N106菌株的最小抑制劑量為3 u/mL。

2.2 紫外致死曲線的繪制 紫外照射劑量與致死率之間在一定范圍內(nèi)存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系見(jiàn)圖1。

圖1 紫外線照射N106致死率曲線圖

由圖1可以看出，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率逐漸升高，當(dāng)照射時(shí)間超過(guò)60 s時(shí)，致死率達(dá)到90%以上。一般認(rèn)為殺菌率以90.0% ～99.9%效果較好，但也有報(bào)道認(rèn)為，較低的殺菌率有利于正突變菌株的產(chǎn)生［3］。因此，本次試驗(yàn)選用致死率達(dá)到90%但并非最高的60 s作為紫外線誘變劑量。

2.3 鏈霉素抗性突變株的篩選 通過(guò)紫外誘變及鏈霉素抗性篩選，在鏈霉素濃度為3 u/mL的篩選培養(yǎng)基平板上分離得到213株抗性菌株，經(jīng)單菌落發(fā)酵初篩后有26株效價(jià)高于出發(fā)菌株。將初篩效價(jià)高的單菌落移植斜面，經(jīng)過(guò)兩次搖瓶發(fā)酵，用生物效價(jià)檢測(cè)方法測(cè)定那西肽抗性菌株效價(jià)。兩次復(fù)篩效價(jià)均值結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 那西肽抗性菌株復(fù)篩效價(jià)均值統(tǒng)計(jì) u/mL

可以看出，本次利用鏈霉素抗性基因突變篩選法獲得搖瓶發(fā)酵效價(jià)達(dá)3000 u/mL以上的高產(chǎn)菌株共有8株，約占抗性菌株的4%，最高產(chǎn)量菌株NUS182效價(jià)較出發(fā)菌株效價(jià)提高37.97%。

2.4 高產(chǎn)菌株的發(fā)酵產(chǎn)物研究 兩個(gè)高產(chǎn)菌株NUS182、NUS143與對(duì)照菌株N106在同樣工藝條件下，同時(shí)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵液進(jìn)行HPLC檢測(cè)(圖2)。由HPLC圖譜可以看出，以上獲得的高產(chǎn)菌株NUS182、NUS143產(chǎn)生的那西肽圖譜與對(duì)照菌種一致，說(shuō)明誘變菌株NUS182、NUS143效價(jià)水平的提高是那西肽產(chǎn)量增加所致。

圖2 高產(chǎn)菌種NUS182、NUS143與對(duì)照菌種N106搖甁發(fā)酵液HPLC圖譜

2.5 高產(chǎn)菌株穩(wěn)定性研究

2.5.1 高產(chǎn)菌株傳代試驗(yàn) 取 NUS146、NUS182菌株的孢子甘油凍存管，將凍存孢子轉(zhuǎn)接至試管斜面培養(yǎng)上，28℃培養(yǎng)7 d后作為F1代，從F1代斜面轉(zhuǎn)接斜面后F1代冰箱保存，同樣28℃培養(yǎng)7 d為F2代，同樣方式接連傳代到F4，然后分別將F1、F2、F3、F4斜面同時(shí)轉(zhuǎn)接斜面擴(kuò)大培養(yǎng)，28℃培養(yǎng)7 d，即為 F2、F3、F4、F5代。

2.5.2 傳代菌株的搖瓶發(fā)酵 取上述分別培養(yǎng)了7 d 的 F2、F3、F4、F5代孢子斜面，鏟塊(相同大小的菌塊)接種到種子培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)2 d，然后轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，28℃培養(yǎng)7 d。重復(fù)試驗(yàn)3批，平均效價(jià)及相對(duì)于F2代的效價(jià)增減幅度均值統(tǒng)計(jì)情況見(jiàn)表3。

表3 那西肽抗性高產(chǎn)菌株發(fā)酵水平驗(yàn)證

由表3可知，高產(chǎn)突變株NUS146及NUS182均表現(xiàn)為:F3～F4代高產(chǎn)性能相對(duì)穩(wěn)定，F(xiàn)5代產(chǎn)量分別下降了14.98%、13.03%，生產(chǎn)上不可行，故該菌種作為生產(chǎn)菌種使用時(shí)，應(yīng)注意最多傳至4代，傳代過(guò)多，生產(chǎn)水平具有下降的風(fēng)險(xiǎn)。

3 討論

3.1 鏈霉菌產(chǎn)抗生素能力與鏈霉素抗性基因之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系是抗生素科研領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)［4］，用鏈霉素作為致死抗藥性突變標(biāo)志定向篩選誘變后的菌株，有一定的方向性，能極大地提高篩選效率。

3.2 紫外誘變是工業(yè)生產(chǎn)中最常用的誘變方法之一，但由于該方法所致的發(fā)生變異的不定向性與篩選的盲目性，往往篩選工作量大而且效果不佳。本文將傳統(tǒng)誘變方法篩選那西肽產(chǎn)生菌突變株結(jié)合鏈霉素抗性篩選法，在增大突變率的同時(shí)，又提高突變菌株的正變率達(dá)到12.21%，并篩選到了幾株高產(chǎn)菌株，表明對(duì)那西肽菌種誘變后以鏈霉素抗性作為篩選模型對(duì)那西肽菌種水平的提高十分有效。

3.3 在此基礎(chǔ)上，可復(fù)合鏈霉素篩選模型對(duì)那西肽菌種進(jìn)行其他理化因子的誘變嘗試。另外，本研究對(duì)其他鏈霉菌品種的高效育種也有一定的借鑒意義。

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