王翔林，王冠楠，錢 琛，陳 晨，康玉柱

(1.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽 110016;2.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，沈陽 110016;3.沈陽順旺動(dòng)物藥業(yè)有限公司，沈陽 110300)

帕那珠利(Ponazuril)是德國(guó)Bayer公司開發(fā)的一種三嗪酮類抗原蟲和球蟲引起疾病的藥物，化學(xué)名為(1－甲基－3－［3－甲基－4－(4－三氟甲基砜基 －l－苯氧基)－苯基］－［1，3，5］－三嗪 －2，4，6－三酮，結(jié)構(gòu)式見圖1。2001年經(jīng)FDA批準(zhǔn)在美國(guó)上市后迅速占領(lǐng)美國(guó)市場(chǎng)，成為美國(guó)獸醫(yī)常用的抗原蟲藥物之一。目前，帕那珠利在中國(guó)尚未上市，但其強(qiáng)大的抗原蟲效果和相對(duì)低廉的價(jià)格，決定了其在不遠(yuǎn)的將來會(huì)被廣泛使用。

帕那珠利的含量測(cè)定方法主要有兩類:HPLC法和LC－MS法，本文研究的是HPLC法。該方法相比較而言有速度快、成本低、簡(jiǎn)便易行的特點(diǎn)，且原料藥含量較高，沒必要使用液質(zhì)連用檢測(cè)。

帕那珠利雖然早在2001年就在FDA批準(zhǔn)上市，但至今英國(guó)藥典(BP)和美國(guó)藥典(USP)上均不能找到該藥物的原料藥檢測(cè)方法。帕那珠利的最大吸收峰為250 nm(圖2)，本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定方法是在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)確定的。經(jīng)測(cè)試，該色譜條件可以進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀:WATERS公司2695型高效液相色譜分析儀;WATERS公司2487型紫外檢測(cè)器;Diamonsil C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，美國(guó)迪馬公司);工作站:WINDOWS系統(tǒng)下的Empower軟件;KQ5200B超聲波清洗器(江蘇昆山超聲波儀器廠)。AG285型電子天平(METTLER TOLEDO公司，精度為十萬分之一);紫外分光光度計(jì)(SHIMADZU公司UV－1601型)。

帕那珠利對(duì)照品:批號(hào) H20110508，純度99.5%，沈陽順旺動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供;帕那珠利樣品:批號(hào)20110618，沈陽順旺動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供;乙腈為色譜純，Tedia公司;乙酸為優(yōu)級(jí)純，北京化工廠;水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:0.2%乙酸水溶液－乙腈(43∶57);流速1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)255 nm;柱溫35℃。

2.2 樣品和對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱定帕那珠利樣品0.02554 g和對(duì)照品0.02668 g，分別置于100 mL容量瓶中，加入少量流動(dòng)相，超聲溶解后用流動(dòng)相稀釋至刻度，分別作為樣品儲(chǔ)備液和對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋到刻度，搖勻。過 0.45 μm 濾膜后進(jìn)樣 10 μL，結(jié)果見圖3。主峰帕那珠利理論塔板數(shù)為17236，分離度為 12.97，拖尾因子為 0.99。

圖3 系統(tǒng)適用性圖譜

2.4 方法學(xué)研究

2.4.1 線性 分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.4、1、2、3、4 mL，置于 10 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，過 0.45 μm 濾膜，分別進(jìn)樣 10 μL，記錄色譜圖。以峰面積(y)對(duì)進(jìn)樣濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4，得到回歸方程 y=25623x+2253.7，R2=0.9999。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 精密度

2.4.2.1 儀器精密度 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。過 0.45 μm 濾膜后進(jìn)樣 10 μL，重復(fù)進(jìn)樣 5 次，色譜峰面積為 645250、648470、648432、649585、647820，RSD 為 0.25% 。

2.4.2.2 方法重復(fù)性 精密稱定帕那珠利樣品和對(duì)照品，分別置于100 mL容量瓶中，加入少量流動(dòng)相，超聲溶解后用流動(dòng)相稀釋至刻度。然后精密量取樣品和對(duì)照品溶液各1 mL，分別加入到10 mL容量瓶中。用流動(dòng)相稀釋至刻度。搖勻后過0.45 μm濾膜，進(jìn)樣10 μL(每個(gè)樣進(jìn)樣兩次)，計(jì)算樣品的百分含量。結(jié)果見表1，平均含量為99.2%，RSD為0.69%(n=5)。

表1 方法重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.4.3 回收率 精密量取9份樣品儲(chǔ)備液各2.5 mL，分別置于9個(gè)25 mL容量瓶中，然后精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液2.0、2.5、3.0 mL 各 3 份，分別加入上述9個(gè)容量瓶中作為低、中、高濃度組。將9個(gè)容量瓶分別用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻后過0.45 μm濾膜，進(jìn)樣10 μL(每個(gè)樣品進(jìn)樣兩次)，平均后的峰面積見表2，平均回收率為98.6%，RSD為1.2%(n=9)。

2.4.4 穩(wěn)定性 精密量取帕那珠利樣品0.02613 g和對(duì)照品0.02486 g，分別置于100 mL容量瓶中，加入少量流動(dòng)相，超聲溶解后用流動(dòng)相稀釋至刻度。精密量取樣品和對(duì)照品溶液各5 mL，分別加入兩個(gè)50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度。搖勻后過0.45 μm 濾膜，在0、3、6、9、12、15、18、21、24 h進(jìn)樣10 μL(每個(gè)樣品進(jìn)樣兩次平均)，計(jì)算樣品的百分含量，結(jié)果見表3，含量平均為97.2%，RSD為 0.74%。

3 討論與結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)參考了文獻(xiàn)報(bào)道的多種流動(dòng)相條件，并通過大量實(shí)驗(yàn)考察了磷酸鹽緩沖液－乙腈系統(tǒng)、0.5%乙酸銨水溶液－乙腈系統(tǒng)、水－乙腈系統(tǒng)、0.05 mol/L甲酸水溶液 －乙腈系統(tǒng)、0.1%乙酸水溶液－甲醇系統(tǒng)、水－甲醇系統(tǒng)和0.2%乙酸水溶液－乙腈系統(tǒng)等流動(dòng)相條件，最終確定以0.2%乙酸水溶液－乙腈(43∶57)為流動(dòng)相較好。

表2 回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

3.2 帕那珠利的實(shí)測(cè)最大吸收波長(zhǎng)為250 nm，文獻(xiàn)記載的檢測(cè)波長(zhǎng)為255 nm。分別用250 nm和255 nm進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，其吸收度和峰面積均符合實(shí)驗(yàn)要求，且帕那珠利的前體原料托曲珠利的最大吸收為255 nm，采用255 nm檢測(cè)有利于帕那珠利和其雜質(zhì)的檢測(cè)，因而最終決定采用255 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 本實(shí)驗(yàn)條件理論塔板數(shù)很高，被測(cè)組分與雜質(zhì)的分離度較好，拖尾因子在0.95～1.05之間。說明實(shí)驗(yàn)的色譜條件非常適合進(jìn)行含量測(cè)定。

［1］Dirikolu L，Yohn R，Garrett E F，et al.Quantifications and pharmacokinetics of toltrazuril sulfone(ponazunil)in cattle［J］.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，2009，32(3):280－288.

［2］Dirikolu L，Karpiesiuk W，Lehner A F，et al.Synthesis and detection of toltrazuril sulfone and its pharmacokinetics in horses following administration in dimethylsulfoxide［J］.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，2009，32(4):368－378.

［3］Hui L，James K P，Sherri B T，et al.A multi－ class method by liquid chromatography－quadrupole ion trap mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography，2006，836(1/2):22 －38.

［4］Mulder P P J，Balzer－ Rutgers P，Brinke E M，et al.Deposition and depletion of the coccidiostats toltrazuril and halofuginone in eggs［J］.Analytica Chimica Acta，2005，529(1/2):331 －337.

［5］Victor H，Magne Y，Oyvin O.Determination of flunixin and tiamulin hydrogen fumarate in meat and toltrazuril and the metabolite toltrazurilsulfon in meat and eggs using LC/MS［J］.Journal of Liquid Chromatography ＆ Related Technologies，2003，26(5):791－801.

［6］Anna M V，Encarnacion M，Martins Claudia P B，et al.Fast liquid chromatography/tandem massspectrometry (highly selective selected reaction monitoring)for the determination of toltrazuril and its metabolites in food［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2010，397(7):2893 －2901.

［7］Myoung－Seok K，Jong－ Hwan L，Youn － Hwan H，et al.Plasma disposition of toltrazuril and its metabolites，toltrazuril sulfoxide and toltrazuril sulfone，in rabbits after oral administration［J］.Veterinary Parasitology，2010，169(1/2):51 －56.

［8］Yingjie X，Hangru H，Yonggang G，et al.Determination of toltrazuril and metabolite in chicken plasma by LC/MS［J］.Nanjing Nongye Daxue Xuebao，2006，29(1):127－130.