李 倩，張玉潔，王鶴佳，仲 鋒，徐秉恩

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

噁喹酸和氟甲喹是第二代喹諾酮類藥物，其抗菌譜廣，殺菌力強，吸收快，對治療革蘭氏陰性菌感染，特別是對大腸桿菌、支原體、嗜水氣單胞菌引起的畜、禽及水生動物疾病有較好療效［1－2］。本類藥物一般毒性較低，安全范圍大。但隨著噁喹酸和氟甲喹在獸醫(yī)臨床上的廣泛應用，其產(chǎn)生的毒副作用仍會對人體產(chǎn)生直接的危害，因此其在可食性動物組織中的殘留問題已經(jīng)日益引起人們的關(guān)注。農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布的第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定:噁喹酸在雞蛋中的最高殘留限量為50 μg/kg，氟甲喹在奶中的最高殘留限量為50 μg/kg。有關(guān)噁喹酸、氟甲喹在動物性產(chǎn)品殘留檢測方法的文獻報道較多，主要是高效液相色譜法［3－4］，且多用于測定各類魚［5－6］、蝦組織中的殘留量。測定雞蛋和牛奶中的這兩種藥物殘留還未見報道。本研究旨在建立一種同時檢測兩種藥物在雞蛋和牛奶中殘留量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和設備 Agilent1100高效液相色譜儀(配熒光檢測器和二元梯度洗脫系統(tǒng))C18色譜柱;保護柱;分析天平:感量0.00001 g;天平:感量0.01 g;組織勻漿機;渦旋混合儀;振蕩器;高速離心機;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 試劑和溶液 噁喹酸標準品(含量≥98.0%);氟甲喹標準品(含量≥99.0%);氫氧化鈉、甲酸、磷酸均為分析純;四氫呋喃、乙腈、正丙醇均為色譜純;水為去離子水。

噁喹酸和氟甲喹標準儲備液:精密稱取噁喹酸、氟甲喹標準品各約10 mg于10 mL量瓶中，用0.03 mol/L氫氧化鈉溶液溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的標準儲備液。

噁喹酸和氟甲喹標準工作液:準確量取適量噁喹酸和氟甲喹標準儲備液，用乙腈稀釋成適宜濃度的噁喹酸和氟甲喹標準工作液。

5.0 mol/L氫氧化鈉溶液:取氫氧化鈉飽和液28 mL，加水稀釋至100 mL。

0.03 mol/L氫氧化鈉溶液:取5.0 mol/L氫氧化鈉液0.6 mL，加水稀釋至100 mL。

0.02 mol/L 磷酸溶液:取 85%磷酸 1.36 mL，加水稀釋至1000 mL。

1%甲酸乙腈溶液:取98%甲酸10 mL，加乙腈稀釋至1000 mL。

1.3 色譜條件 流動相:0.02 mol/L磷酸溶液－乙腈－四氫呋喃(68∶16∶16);檢測波長:激發(fā)波長325 nm，發(fā)射波長369 nm;柱溫30℃;流速0.8 mL/min;進樣量 20 μL。

1.4 標準曲線的繪制 精密量取適量噁喹酸和氟甲喹標準工作液，用流動相稀釋成濃度為3、10、50、100、300、500 ng/mL 的系列溶液。

1.5 樣品的提取 稱取(2±0.05)g試料，置50 mL離心管中，加1%甲酸乙腈溶液6 mL，渦旋混勻，中速振蕩5 min，10000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入50 mL雞心瓶中，重復提取一遍，合并兩次上清液，加正丙醇3 mL，50～55℃減壓濃縮至干。濃縮物用流動相2.0 mL溶解，混勻后轉(zhuǎn)入5 mL離心管中，8000 r/min離心5 min，取上清液過濾膜后作為試樣溶液，供高效液相色譜分析。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線的測定 將繪制標準曲線用對照溶液依次從低濃度到高濃度，按液相色譜條件進行分析。每一濃度進樣3針，按其所得峰面積的平均值與對應的對照溶液濃度作標準曲線圖(圖1)，并計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。噁喹酸和氟甲喹的線性濃度范圍為3～500 ng/mL，標準曲線方程分別為噁喹酸 y=0.0504x －0.0943，相關(guān)系數(shù) r=0.9992;氟甲喹 y=0.0602x －0.1549，相關(guān)系數(shù) r=0.9991。

圖1 噁喹酸、氟甲喹標準曲線圖

2.2 方法精密度和準確度 分別取雞蛋和牛奶(2±0.05)g，加適量的標準溶液，制成含噁喹酸和氟甲喹濃度為10～100 ng/g的添加樣品，按1.5項下提取處理后進行色譜分析。噁喹酸和氟甲喹標準、空白雞蛋及添加色譜圖見圖2－圖4。取峰面積值計算噁喹酸、氟甲喹的含量，以測得量和加入量之比計算回收率。按照農(nóng)業(yè)部第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》要求，分別測定包括最高殘留限量在內(nèi)的3種濃度，按每個濃度各測5個樣品的回收率計算批內(nèi)相對標準偏差，每個濃度各測3批計算批間相對標準偏差。結(jié)果(表1和表2)表明，方法中噁喹酸和氟甲喹在 10、50、100 ng/g添加水平的平均回收率在73% ～94%之間，批內(nèi)相對標準偏差小于8%，批間相對標準偏差小于12%，結(jié)果重復性好，回收率高，方法的準確度和精密度可以滿足殘留檢測的要求。

表1 雞蛋中噁喹酸和氟甲喹回收率及批內(nèi)批間相對標準偏差測定結(jié)果

表2 牛奶中噁喹酸和氟甲喹回收率及批內(nèi)批間相對標準偏差測定結(jié)果

2.3 方法靈敏度 空白試料按提取方法處理后進行色譜分析，在相應的保留時間處，空白試料對所測分析物無干擾。在雞蛋和牛奶中添加標準溶液，使其在組織中的添加濃度分別為3、5和10 μg/kg。按照1.5項下提取凈化方法處理后，經(jīng)HPLC檢測。測定結(jié)果顯示，添加濃度為5 μg/kg時，藥物的信噪比(S/N)約等于3，添加濃度為10 μg/kg時，信噪比均＞10，為此，確定噁喹酸、氟甲喹在雞蛋和牛奶中的檢測限為5 μg/kg，定量限為10 μg/kg。

3 討論

液—固相萃取是常用的提取、凈化方式，動物性組織中噁喹酸、氟甲喹殘留檢測主要采用液—固相萃取的提取、凈化方法［7］，考慮到雞蛋和牛奶中雜質(zhì)較少，基質(zhì)比較干凈，因此實驗采用液—液萃取方法，省略用固相萃取的凈化的方法，既節(jié)省了實驗的成本，同樣達到了較為理想的色譜分離。

雞蛋和牛奶樣品一般含脂量較高。在實驗提取過程中加入正己烷進行除脂，但提取的結(jié)果與未加正己烷除脂的相比較，無明顯差別，因此僅使用1%甲酸乙腈提取，不加正己烷除脂，減壓濃縮的處理方法即可滿足檢測要求，并具有成本低、樣品處理速度快的特點。

本實驗采用高效液相色譜熒光檢測器檢測，建立了噁喹酸、氟甲喹在雞蛋和牛奶中的殘留檢測方法，具有操作簡便、節(jié)省有機溶劑減少對環(huán)境的污染等特點。其方法的靈敏度、準確度及精密度均達到了獸藥殘留檢測方法的要求，適用于實際樣品的檢測。

［1］沈建忠，謝聯(lián)金.獸醫(yī)藥理學［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2000:162 －167.

［2］楊永勝，閨章年.國內(nèi)魚因抗菌藥物的現(xiàn)狀與展望［J］.中國獸藥雜志，1997，31(2):51 －54.

［3］Pouliquen H，Morvan M L.Determination of residues of oxolinic acid and flumequine in freeze－dried salmon muscle and skin by HPLC with fluorescencedetection［J］.Food Additives ＆Contaminants:Part A，2002，19(3):223 －231.

［4］Germain Carignan，Lyse Larocque，Stephen Sved.Assay oxolinic acid residues in salmon muscle by chromatography with fluorescence detection:Interlaboratory study［J］.Association of official Analytical Chemists，1991，74(6):906 －909.

［5］仲 鋒，董琳琳，汪 霞.噁喹酸、氟甲喹在魚組織中殘留量的檢測方法研究［J］.中國獸藥雜志，2002，36(11):20 －22.

［6］劉艷萍，冷凱良，王清印，等.高效液相色譜法測定鰻魚中氟甲喹和噁喹酸的殘留量［J］.上海海洋大學學報，2009，18(3):332－337.

［7］仲 鋒，汪 霞，董琳琳，等.噁喹酸、氟甲喹在雞組織中殘留量的檢測方法研究［J］.中國獸藥雜志，2002，36(9):19 －21.