蘆愛萍,林岳華,張?zhí)K婉,張 進(jìn),劉冬華
(1.深圳市第七人民醫(yī)院兒科,廣東湛江 524000;2.深圳市第五人民醫(yī)院兒科,廣東深圳 518000;3.深圳市橫崗人民醫(yī)院康復(fù)科,廣東深圳 518115)
ORMDL3基因多態(tài)性在哮喘高?;純褐械难芯?/p>
蘆愛萍2,林岳華1※,張?zhí)K婉3,張 進(jìn)2,劉冬華2
(1.深圳市第七人民醫(yī)院兒科,廣東湛江 524000;2.深圳市第五人民醫(yī)院兒科,廣東深圳 518000;3.深圳市橫崗人民醫(yī)院康復(fù)科,廣東深圳 518115)
目的探討廣東深圳地區(qū)漢族哮喘高危新生兒ORMDL3基因單核甘酸多態(tài)性現(xiàn)象,為預(yù)測(cè)當(dāng)?shù)叵呶P律鷥合l(fā)生的可能性和風(fēng)險(xiǎn)度提供依據(jù)。方法采用病例-對(duì)照研究,對(duì)廣東深圳地區(qū)漢族30例哮喘高危新生兒和30例健康新生兒進(jìn)行研究,利用DNA抽提試劑盒提取試驗(yàn)對(duì)象外周血的DNA,通過聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)聯(lián)合DNA片段測(cè)序?qū)RMDL3基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs7216389進(jìn)行基因型和等位基因頻率分析。結(jié)果ORMDL3基因上的rs7216389位點(diǎn),哮喘高危組中出現(xiàn)單核甘酸多態(tài)性有23例(76.7%)。其中CT型6例(20.0%),TT型17例(56.7%)。對(duì)照組中出現(xiàn)核苷酸多態(tài)性有12例(40%)。其中CT型4例(13.3%),TT型8例(26.7%)。哮喘高危組和對(duì)照組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論rs7216389位點(diǎn)單核甘酸多態(tài)性與哮喘高危組相關(guān)聯(lián),可能為廣東深圳地區(qū)漢族人群中支氣管哮喘的易感位點(diǎn)。
基因;哮喘;新生兒
過敏性疾病是導(dǎo)致支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)的主要因素,尤其在兒童中發(fā)病率高,嚴(yán)重危害著全球的公共健康。哮喘是由環(huán)境因素和遺傳因素相互作用的一種多基因性遺傳疾病,它不遵循孟德爾遺傳規(guī)律,具有明顯的家族聚集趨勢(shì),歐洲國(guó)家在雙胞胎中進(jìn)行的幾個(gè)大規(guī)模哮喘遺傳力的研究,表明遺傳因素在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用,特別是在以下五個(gè)染色體區(qū)域,存在大量的哮喘相關(guān)基因,它們分別是5q31~32、6p21、11q12~13、16p11~12 和20p13,而ORMDL3基因和哮喘的關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)。本研究選取該基因上一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)rs7216389(GAGGC AACCC TGGAA AGTCACAAAC A[C/T]GCA TGGAC TCGGC CCTGATTGAT CA)進(jìn)行多態(tài)性分析,分析ORMDL3基因和哮喘高危新生兒的關(guān)系。
1.1 研究對(duì)象 病例組來自2009年9月至2010年7月在本院產(chǎn)科出生的新生兒,根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)確定的哮喘高危兒30例,其中男16例,女14例;對(duì)照組為產(chǎn)科的健康新生兒共30例,其中男 17例,女 13例。所有研究對(duì)象在妊娠期間,孕母在知情同意下,通過詢問和查閱病史的方法進(jìn)行調(diào)查,了解受試者家族中過敏性疾病及哮喘病史,納入研究對(duì)象的新生兒在出生當(dāng)天抽取靜脈血2 mL行檢測(cè),同時(shí)記錄新生兒性別、胎齡、體質(zhì)量等一般情況。
1.2 試驗(yàn)材料 普通聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀、MyCycler(USA BIORAD)水平電泳系統(tǒng)、Sub-Cell(USA BIORAD)凝膠成像系統(tǒng)、gel-doc(USA BIORAD)臺(tái)式冷凍離心機(jī)、5417R(GM EPPENDORF)水浴鍋(江蘇海門麒麟貝爾儀器制造有限公司)、滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)、烘箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、移液器(Eppendorf)、無水乙醇(上?;瘜W(xué)試劑公司)。血液基因組DNA提取試劑:E.ZNA Blood DNA Kit,OMEGA;PCR 試劑盒:fermentas AGROSE,SPAIN,50;TAE:ROMEGA。
1.3 研究方法
1.3.1 全血基因組DNA的提取(OMEGA提取說明書) ①每份樣品250 μL血液至干凈離心管;②加入 25 μL OB 蛋白酶和 250 μL BL,室溫渦旋 15 s,每個(gè)樣品加入5 μL RNA酶(50 mg/mL);③65℃水浴10 min;④加入260 μL無水乙醇,在震蕩器上混勻后把液體加入HiBind DNA柱收集管套柱中,10 000×g離心1 min,棄收集管和流出液;⑤將HiBind DNA套柱在2 mL收集管中,500 μL Buffer HB 液,10 000×g離心1 min,棄流出液;⑥將HiBind DNA套柱在2 mL收集管中,700 μL DNA Wash Buffer,10 000 ×g離心1 min,棄流出液,重復(fù)一次;⑦將HiBind DNA套柱在2 mL收集管中,12 000×g離心2 min,干燥柱子基質(zhì);⑧將HiBind DNA套柱在1.5 mL收集管中,加入150 μL 65 ℃ 水浴 DNA Elution Buffer,室溫 5 min;⑨室溫12 000×g離心1 min,洗脫收集DNA,重復(fù)一次,-20℃保存DNA備用。
1.3.2 PCR的操作步驟 ①引物探針設(shè)計(jì)。rs7216389的一對(duì)引物為,F(xiàn):5-GGAGGCTGAGGTGGGTAGAT-3,R:5-TGGGAGGTTGGAGACAAAGG-3,大小為443 bp。②隨機(jī)取幾個(gè)樣品進(jìn)行預(yù)試驗(yàn),然后確定反應(yīng)條件(表1)。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 Excel建立數(shù)據(jù)庫,選用SAS 9.2軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物結(jié)果判定聚合酶鏈反應(yīng) 產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為443 bp,電泳圖見圖1。對(duì)符合要求的聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序,測(cè)序后基因分型見圖2、3。在試驗(yàn)組和對(duì)照組中,尚未發(fā)現(xiàn)TC型基因,可能和樣本量過少有關(guān)。哮喘高危組中出現(xiàn)單核甘酸多態(tài)性有23例(76.7%),對(duì)照組中出現(xiàn)核苷酸多態(tài)性有12例(40%)。高危組和對(duì)照組中,等位基因T的頻率分別為66.7%和33.3%,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.48,P<0.05)。
圖1 PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果
圖2 TT基因型
圖3 CC基因型
表2 rs7216389位點(diǎn)基因型分析 [例(%)]
本試驗(yàn)對(duì)ORMDL3基因上的兩位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析,其中rs7216389位點(diǎn)基因型(CC/TC/TT)分布頻率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。哮喘高危組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明該位點(diǎn)與廣東深圳地區(qū)漢族哮喘高危新生兒相關(guān)聯(lián),ORMDL3基因rs7216389位點(diǎn)可能為漢族人群哮喘高危新生兒的易感位點(diǎn)。
隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展,全基因掃描方法的引入,Moffatt等[1]首次應(yīng)用此方法發(fā)現(xiàn) ORMDL3基因上的SNP變異與哮喘呈強(qiáng)關(guān)聯(lián)。994例首發(fā)兒童哮喘患者參加了本次研究,對(duì)317 000個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)在染色體17q12~q21上存在和哮喘有較強(qiáng)關(guān)聯(lián)的多個(gè)SNP位點(diǎn),包括ORMDL3上的多個(gè)SNP位點(diǎn),其中rs7216389位點(diǎn)與哮喘的關(guān)聯(lián)性最強(qiáng),而且ORMDL3基因在類淋巴母細(xì)胞中的表達(dá)與哮喘相關(guān)。這些均提示ORMDL3基因上存在著哮喘易感位點(diǎn)。其研究還表明ORMDL3基因變異決定兒童哮喘的易感性。
Tavendale等[2]在蘇格蘭青少年中發(fā)現(xiàn)ORMDL3基因中的SNP rs7216389與哮喘易感性及病情惡化相關(guān),Hirota 等[3]在日本人中也有同樣的發(fā)現(xiàn)。Wu 等[4]研究發(fā)現(xiàn)ORMDL3基因及其鄰近基因GSDML與兒童哮喘相關(guān),這些結(jié)果表明,染色體17q21上的ORMDL3及其相鄰基因都與兒童哮喘呈顯著相關(guān)?;虮磉_(dá)水平在不同地區(qū)、不同環(huán)境下有所不同,一定條件下地理和環(huán)境因素差異將影響基因表達(dá)情況。Leung等[5]鑒定SNP位點(diǎn)rs7216389及rs11650680在中國(guó)南方兒童中與哮喘相關(guān)。然而,其與中國(guó)北方兒童哮喘易感性之間的關(guān)聯(lián)依然未知。Sleiman等[6]對(duì)歐洲的北美人群進(jìn)行的研究,研究對(duì)象均來自于費(fèi)城兒童醫(yī)院,其中白人組有哮喘兒童807例,健康兒童2583例,對(duì)于美國(guó)非洲人群納入研究對(duì)象的哮喘兒童有1456例,健康兒童1973例。分別對(duì)其ORMDL3基因上的9個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析,結(jié)果表明有7個(gè)SNP位點(diǎn)與兒童哮喘關(guān)聯(lián),其中包括rs7216389。
本試驗(yàn)中的ORMDL3基因位點(diǎn)rs7216389與哮喘高危組具有相關(guān)性,與以往研究結(jié)果一致,可能為支氣管哮喘易感SNP。但由于遺傳變異和疾病之間的相關(guān)性受很多因素的影響,一個(gè)與疾病表型強(qiáng)關(guān)聯(lián)的SNP的確定并不一定意味它就是致病SNP。相關(guān)SNP可能是和真正的致病SNP連鎖,但是在連鎖不平衡區(qū)域內(nèi)的不同位置。致病變異僅僅是可能位于相關(guān)SNP相同的或鄰近的基因上。隨著后基因組時(shí)代、蛋白組學(xué)等進(jìn)一步發(fā)展,支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制必將不再是一個(gè)謎團(tuán)。
[1]Moffatt MF,Kabesch M,Liang L,et al.Genetic variants regulating ORMDL3 expression contribute to the risk of childhood asthma[J].Nature,2007,448(7152):470-473.
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[3]Hirota T,Harada M,Sakashita M,et al.Genetic polymorphism regulating ORM1-like 3(Saccharomyces cerevisiae)expression is associated with childhood atopic asthma in a Japanese population[J].J Allergy Clin Immunol,2008,121(3):769-770.
[4]Wu H,Romieu I,Sienra-Monge JJ,et al.Genetic variation in ORM1-like 3(ORMDL3)and gasdermin-like(GSDML)and childhood asthma[J].Allergy,2009,64(4):629-635.
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[6]Sleiman PM,Annaiah K,Imielinski M,et al.ORMDL3 variants associated with asthma susceptibility in North Americans of European ancestry[J].J Allergy Clin Immunol,2008,122(6):1225-1227.
Study of ORMDL3 Gene Polymorphism in Asthma High-risk Children
LU Ai-ping2,LIN Yue-hua1,ZHANG Su-wan3,ZHANG Jin2,LIU Dong-hua2.(1.Pediatrics Department,Shenzhen Seventh People's Hospital,Zhanjiang524000,China;2.Pediatrics Department,Shenzhen Fifth People's Hospital of Shenzhen,Shenzhen518000,China;3.Rehabilitation Department,Henggang People's Hospital,Shenzhen518115,China)
ObjectiveTo study ORMDL3 gene polymorphism in high-risk asthma newborns born in Han nationality in Shenzhen Guangdong,in order to provide basis to predict the possibility and risk of asthma of local newborns.MethodsThis was a case-control study,which enrolled 30 cases infants at high risk of asthma and 30 healthy newborns of Han from Shenzhen,Guangdong.Genomic DNA was extracted from cells in the peripheral blood by using DNA extraction kit.PCR and DNA sequencing combined technology was used to analyze the genotype and gene frequency of rs7216389 in ORMDL3.ResultsFor the rs7216389 in ORMDL3 gene locus,high-risk group of single nucleotide polymorphisms occurred in 23 cases(76.7%).6 cases with CT-type(20%),TT-type 17 cases(56.7%).Nucleotide polymorphisms in the control group were 12 cases(40%).4 cases with CT-type(13.3%),8 cases with TT-type(26.7%).Difference between the high-risk group and control group was statistically significant(P<0.05).ConclusionStudy for two SNPs in ORMDL3 gene loci have shown that rs7216389 single nucleotide polymorphism loci in high-risk group is associated with asthma risk cases,and it may be asthma susceptibility locus in Chinese Han population of Shenzhen Guangdong.
Genes;Asthma;Newborns
R725.6
A
1006-2084(2012)13-2111-03
2011-06-14
2012-02-14 編輯:樓立理