李 蕾，李之俊

(1.淮北師范大學(xué)體育學(xué)院，安徽 淮北 235000;2.上海體育科學(xué)研究所，上海 200030)

經(jīng)常進(jìn)行有氧運(yùn)動能夠增強(qiáng)機(jī)體糖脂代謝能力，提高與能量代謝相關(guān)的細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子的活性以及機(jī)體對胰島素的敏感性，預(yù)防胰島素抵抗(insulin resistant，IR)的發(fā)生[1]。脂聯(lián)素是目前脂肪因子中唯一與體脂含量負(fù)相關(guān)，具有保護(hù)作用的因子，通過脂聯(lián)素受體的介導(dǎo)參與體內(nèi)糖脂代謝調(diào)節(jié)、能量代謝、抗炎和抗動脈粥樣硬化等生物學(xué)效應(yīng)。因此，有氧運(yùn)動是否通過影響脂聯(lián)素受體表達(dá)而增強(qiáng)胰島素敏感性?目前運(yùn)動對脂聯(lián)素受體基因水平影響的研究較少，且結(jié)論很不一致。本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察高脂膳食和運(yùn)動條件下SD大鼠骨骼肌和肝臟脂聯(lián)素受體基因表達(dá)的變化，以探討脂聯(lián)素受體在運(yùn)動延緩大鼠IR形成中發(fā)揮的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及運(yùn)動干預(yù)方案[2]

SD純系7周齡雄性大鼠46只，體重 180～200g，SPF級。分為4組(n=12):普食對照組(C組)、普食運(yùn)動組(E組)、高脂膳食對照組(H組)、高脂膳食運(yùn)動組(HE組)。

普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，C組和E組繼續(xù)普食喂養(yǎng)，H組和HE組改高脂飼料喂養(yǎng)。同時(shí)E組和HE組開始進(jìn)行無負(fù)重游泳訓(xùn)練。方案采用Ploug等報(bào)道的方法，水溫(33±2)℃，水深50cm，保證每只大鼠有 200cm2的活動面積以保證持續(xù)運(yùn)動。第一周30min/d，第二周 30～60min/d，第三周60～90min/d，第四周維持90min/d直至實(shí)驗(yàn)?zāi)?。每?天，共持續(xù)10周。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 運(yùn)動組末次運(yùn)動結(jié)束48 h后，再禁食12 h(即末次運(yùn)動后60h采集標(biāo)本)，以10%水合氯醛按40～45 mg/kg bw腹腔內(nèi)麻醉后，將大鼠仰臥位固定于大鼠手術(shù)臺上，逐層打開腹腔，于下腔靜脈取血6 ml左右，靜置后離心取血清，-20℃保存。隨后迅速取整肝，取雙側(cè)大腿紅色股四頭肌，迅速投液氮，后裝入-80℃冰箱凍存，待測肝臟和骨骼肌脂聯(lián)素受體的基因表達(dá)情況。

1.2.2 測試指標(biāo)

1.2.2.1 大鼠骨骼肌AdipoR1/R2 mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

1.2.2.2 大鼠肝臟AdipoR1/R2 mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 取大鼠骨骼肌(肝臟)組織200mg，于液氮中迅速研磨至粉末狀，每50mg加入1ml Trizol充分快速勻漿，經(jīng)過分相和沉淀，抽提總R NA。瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度計(jì)觀察條帶完整性，測定OD260/OD280比值在1.8～2.0之間。使用Promega，Madison，WI提供的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，取 RNA 2 ug進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。于GenBank上查找大鼠脂聯(lián)素受體和GAPDH的基因序列，Realtime PCR引物由ABI公司 Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。進(jìn)行后續(xù)的熒光定量PCR。AdipoR1的引物序列為:上游 5′-GCTGGCCTTTATGCTGCTCG-3′，下 游 5′-TCTAGGCCGTAACGGAATTC-3′。AdipoR2的引物序列為:上游 5′-CCCTCTGCAAGAGAAAGTGG-3′，下游 5′-TAGCCAGCCTATCTGCCCTA-3′。 GAPDH 內(nèi)參的引物序列為 :上游 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。取上述cDNA樣品按 5倍稀釋，依次加入 SYBR GREEN5μl，上下游引物各 1 ul，ddH202.5μl，總反應(yīng)體系為10μl，輕彈管底將溶液混合，5000r/min短暫離心。反應(yīng)溫度程序60℃2min，95℃10min，接著40個(gè)循環(huán)(95℃15 s，60℃1 min)。所有樣品應(yīng)用GAPDH作內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 AdipoR1/R2分布的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

對C組大鼠的檢測結(jié)果表明，AdipoR1 mRNA以股四頭肌表達(dá)較為豐富，與肝臟表達(dá)比較，差異有顯著性(P＜0.05，表1)。AdipoR2 mRNA在肝臟高表達(dá)，與股四頭肌表達(dá)比較，差異有顯著性(P＜0.05，表1)。

Tab.1 Distributions of adiponectin receptors in normal rats(，n=10-12)

Tab.1 Distributions of adiponectin receptors in normal rats(，n=10-12)

AdipoR:Adiponectin receptor*P＜0.05 vs liver;#P＜0.05 vs skeletal muscle

Receptor types AdipoR mRNA expression Skeletal muscle Liver AdipoR1 4.45±0.54* 3.21±0.76 AdipoR2 3.02±0.91 4.11±0.51#

2.2 骨骼肌 AdipoR1、肝臟AdipoR2 mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

大鼠紅色股四頭肌AdipoR1 mRNA表達(dá)量以C組最高，HE組最低。肝臟AdipoR2 mRNA表達(dá)量以C組最高，H組最低。其中，H組股四頭肌AdipoR1 mRNA、肝臟AdipoR2 mRNA表達(dá)顯著低于 C組(P＜0.05，表 2)，兩運(yùn)動組(E組和HE組)均與同類安靜組水平相當(dāng)(P＞0.05，表2)。

Tab.2 Expression of adiponectin receptor1 in skeletal muscle and adiponectin receptor 2 in liver(，n=10-12)

Tab.2 Expression of adiponectin receptor1 in skeletal muscle and adiponectin receptor 2 in liver(，n=10-12)

C:Normal dietary control group;E:Normal dietary exercise group;H:High fat dietary control group;HE:High fat dietary exercise group;AdipoR1:Adiponectin receptor1;AdipoR2:Adiponectin receptor 2*P＜0.05 vs C group

Group AdipoR1 AdipoR2 C 3.71±0.20 3.8±0.38 E 3.42±0.17 3.5±0.19 H 3.01±0.16* 2.81±0.13*HE 2.78±0.12 2.91±0.10

3 討論

2003年2月Yamauchi T成功克隆出人與小鼠脂聯(lián)素受體基因，分別定義為AdipoR1和AdipoR2。人與小鼠AdipoR1和R2均有95%以上同源性。受體與脂聯(lián)素的親和力同脂聯(lián)素敏感性密切相關(guān)。研究表明，AdipoR1所調(diào)節(jié)的脂肪酸氧化作用對球形脂聯(lián)素高度敏感，而抵抗全長脂聯(lián)素的作用。AdipoR2主要表達(dá)于肝臟，同時(shí)為兩種脂聯(lián)素的中等結(jié)合力受體。目前對脂聯(lián)素受體分布的研究只限于人和小鼠及Wistar大鼠，尚缺乏對SD大鼠的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，肝臟和股四頭肌AdipoR1、R2均有表達(dá)，股四頭肌以AdipoR1高表達(dá)，肝臟以AdipoR2高表達(dá)。這與龔燕平、Yamauchi等研究結(jié)果一致。不同種類脂聯(lián)素受體分布的不同可能是脂聯(lián)素對各器官特異性作用的基礎(chǔ)。骨骼肌AdipoR1高表達(dá)和肝臟AdipoR2高表達(dá)，保證了脂聯(lián)素可以準(zhǔn)確通過不同受體發(fā)揮其反饋調(diào)節(jié)或改善代謝的作用。

Yamauchi等用脂聯(lián)素及其受體1作用 C2C12肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)AMPK及ACC磷酸化增加，說明脂聯(lián)素通過與AdipoR1結(jié)合后，活化AMPK進(jìn)而在肌細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)作用。AdipoR2主要表達(dá)于肝臟，故認(rèn)為AdipoR2是調(diào)節(jié)肝臟脂聯(lián)素敏感性的主要受體，其表達(dá)改變主要影響肝糖輸出和胰島素敏感性。A.E.Civitarese及Tauchida等研究顯示，AdipoR1和R2基因表達(dá)水平與胰島素敏感指數(shù)(ISI)顯著正相關(guān)，而與空腹胰島素(FINS)和胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)顯著負(fù)相關(guān)，有力支持了兩種受體在調(diào)節(jié)胰島素敏感性上均起重要作用。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠紅色股四頭肌AdipoR1和肝臟AdipoR2mRNA表達(dá)有相似變化趨勢。即AdipoR1和R2 mRNA在ISI較高的C組表達(dá)顯著高于ISI較低的H組。這與Bullen JW等[3]對小鼠的研究結(jié)果一致。提示骨骼肌AdipoR1 mRNA表達(dá)和肝臟AdipoR2 mRNA表達(dá)的下調(diào)可能參與介導(dǎo)了高脂大鼠IR的形成。

近年來，急性和長期運(yùn)動訓(xùn)練對脂聯(lián)素受體基因水平表達(dá)影響的研究陸續(xù)有報(bào)道。CHANGSP[4]等研究耐力訓(xùn)練對肥胖Zucker大鼠AdipoR表達(dá)影響的結(jié)果表明，骨骼肌AdipoR1低表達(dá)，瘦的對照組正常。HUANG H等研究耐力訓(xùn)練對KKAy糖尿病小鼠AdipoR表達(dá)影響的結(jié)果表明，骨骼肌和肝臟AdipoR1表達(dá)升高，AdipoR2表達(dá)不變。另一項(xiàng)對健康Wistar大鼠耐力訓(xùn)練后AdipoR表達(dá)變化的研究顯示，5 d/W低強(qiáng)度訓(xùn)練，骨骼肌AdipoR1表達(dá)上升。以上研究結(jié)果一方面顯示出目前運(yùn)動影響AdipoR的研究結(jié)果存在不確定結(jié)論，這可能與不同實(shí)驗(yàn)采用的研究對象和運(yùn)動干預(yù)方案不同有關(guān)，另一方面也提示了脂聯(lián)素受體的表達(dá)依賴于運(yùn)動的強(qiáng)度、頻率和持續(xù)時(shí)間(只在一定的運(yùn)動強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間很長的運(yùn)動后才發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素受體基因表達(dá)的變化)。本實(shí)驗(yàn)中，兩運(yùn)動組AdipoR1和R2(E組和HE組)均與同類安靜組水平相當(dāng)，未發(fā)現(xiàn)運(yùn)動對脂聯(lián)素受體水平產(chǎn)生顯著性影響，可能與10周的游泳運(yùn)動訓(xùn)練時(shí)間不夠長有關(guān)。也有可能是運(yùn)動過程中腎上腺素的釋放導(dǎo)致了一系列抑制修正效應(yīng)。有研究報(bào)道，β激動劑降低了3T3-L1脂肪細(xì)胞中AdipomRNA的表達(dá)。大鼠運(yùn)動1周后，未發(fā)現(xiàn)脂肪組織中Adipo mRNA表達(dá)增加，而腎上腺素水平卻顯著性的升高了，提示運(yùn)動中腎上腺素的釋放可能抑制了Adipo mRNA的表達(dá)[5]。此外，以往對瘦素與運(yùn)動關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)瘦素有延遲性變化，脂聯(lián)素也可能存在延遲性變化，提示今后可增加檢測點(diǎn)。運(yùn)動能降低循環(huán)瘦素水平已得到較一致的認(rèn)可，但是運(yùn)動在能否升高脂聯(lián)素及其受體水平上則結(jié)論不太一致。瘦素和脂聯(lián)素可能存在交互作用:高瘦素水平可能抑制脂聯(lián)素及其受體發(fā)揮作用。因此，今后研究還應(yīng)更加關(guān)注脂肪因子間的交互作用在運(yùn)動改善胰島素敏感性中的作用。

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[2]李 蕾，李之俊，魏安奎，等.胰島素抵抗動物模型和運(yùn)動干預(yù)模型的建立與評價(jià)[J].武漢體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，43(8):51-54.

[3]Bullen J W Jr，Bluher S，Kelesidis T，et al.Regulation of adiponectin and its receptor in response to development of diet-induced obesity in mice[J].Am J Physiol Endoc rinol Metab，2007，292(4):E1079-1086.

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