王 波，方以群，張存海

(1.解放軍第117醫(yī)院，浙江 杭州 310013;2.海軍醫(yī)學(xué)研究所，上海 200433)

隨著現(xiàn)代交通事故的增多，體育運(yùn)動(dòng)損傷的漸增，以及其他一些致傷因素的存在，脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)呈顯著增加的趨勢(shì)，極大地危害著人類健康。目前對(duì)脊髓損傷的治療成為了世界各國(guó)科研工作中的熱點(diǎn)。但是由于神經(jīng)元的生存能力差，神經(jīng)軸突缺乏自發(fā)的再生能力及脊髓斷端的抑制性生長(zhǎng)環(huán)境，主要是炎性環(huán)境，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自我修復(fù)能力非常有限。高壓氧作為脊髓損傷后的有效輔助康復(fù)手段，臨床上已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，但具體干預(yù)機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)以SD大鼠作為研究對(duì)象，建立不完全性脊髓損傷模型，觀測(cè)高壓氧治療是否可通過(guò)減輕脊髓斷端的炎性反應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)物行動(dòng)功能的恢復(fù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

45只健康雄性SD大鼠購(gòu)自上海西普爾畢凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，平均體重(250±2.81)g，海軍醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物飼養(yǎng)中心飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組(n=15):假手術(shù)組，單純暴露脊髓;脊髓損傷對(duì)照組;高壓氧治療組:脊髓損傷術(shù)后12 h內(nèi)行高壓氧治療，大鼠呼吸 2絕對(duì)大氣壓(absolute atmosphere，ATA)的100%O2，每天 90min，治療維持至移植后2周。

1.2 主要試劑

大鼠腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、γ干擾素(IFN-γ)酶鏈免疫(ELISA)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Ebiosience公司。

1.3 不完全性脊髓損傷大鼠模型的建立

參照改良的Allen重物打擊法制作大鼠脊髓背側(cè)損傷模型:實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食8 h，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，背部脫毛后俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒，腰背部正中切口，逐層分開(kāi)顯露T8-T10椎板，行T9全椎板切除，暴露硬脊膜，鉗夾固定T8及T10棘突，用10g的不銹鋼棒(直徑為2.5 mm)沿帶有刻度的玻璃導(dǎo)管從25 mm高處垂直下落，打擊在由塑料材料制成的底部呈凹面、直徑為3 mm的撞桿上，后者將打擊力傳遞給脊髓，造成大鼠脊髓不完全損傷，致傷后迅速移開(kāi)打擊物，逐層縫合。模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn):打擊后損傷處脊髓出血、水腫，大鼠出現(xiàn)擺尾反射，雙下肢及軀體回縮樣撲動(dòng)，麻醉清醒后雙下肢呈弛緩性癱瘓。

1.4 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定

活動(dòng)能力評(píng)定采用開(kāi)放區(qū)行走評(píng)分系統(tǒng)。應(yīng)用BBB評(píng)分系統(tǒng)(Basso，Bresnahan&Bresnahan locomotor rating scale，BBB scale)評(píng)定動(dòng)作能力的恢復(fù)[1]。分別在手術(shù)后1、2、3、4周進(jìn)行盲法BBB評(píng)分，由兩名熟悉BBB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的非實(shí)驗(yàn)人員觀察。將動(dòng)物置于直徑1m的平面光滑場(chǎng)地自由活動(dòng)5min，觀察記錄其后肢的行走及肢體活動(dòng)。評(píng)分分三部分:第一部分為0～7分，評(píng)判動(dòng)物后肢各關(guān)節(jié)活動(dòng);第二部分為8～13分，評(píng)判后肢的步態(tài)及協(xié)調(diào)功能;第三部分為14～21分，評(píng)判運(yùn)動(dòng)中爪的精細(xì)動(dòng)作，三項(xiàng)滿分為21分。

1.5 炎癥因子的檢測(cè)

手術(shù)后14 d，以T8-T10損傷段為中心取材，切取頭尾段在內(nèi)的1 cm長(zhǎng)脊髓組織，每組5個(gè)，置于SDS緩沖液中勻漿，12000×g離心10min后，取上清，各100μl加入96孔板中，4℃過(guò)夜，1%BSA 封閉后，和抗TNF-a，IL-6、IFN-γ的抗體，37℃下孵育6 h后，加入二抗，450nm處測(cè)定吸收光度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果采用SPSS 11.5軟件處理，觀察數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，2個(gè)以上樣本均數(shù)的比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 HBO對(duì)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響

高壓氧組和非高壓氧組相比各時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分值差異明顯(P＜0.05，表1)，說(shuō)明高壓氧對(duì)損傷的脊髓組織有保護(hù)作用。

Tab.1 BBB scores of rats at different points post spinal cord injury(，n=15)

Tab.1 BBB scores of rats at different points post spinal cord injury(，n=15)

HBO:Hyperbaric oxygen*P＜0.05 vs model group

Group 1Week 2Week 3Week 4Week False injury 21 21 21 21 Model 1.2±0.82.5±1.04.5±0.74.9±0.6 HBO 2.3±0.85.2±0.9*8.1±0.6*8.8±0.8*

2.2 HBO對(duì)大鼠脊髓組織炎性因子表達(dá)的影響

ELISA結(jié)果顯示，手術(shù)后第 14 d，相對(duì)于假手術(shù)組，模型組大鼠脊髓組織中炎癥因子顯著增高，經(jīng)高壓氧處理后，炎癥因子含量明顯減少(表2)。

Tab.2 Change of inflammation cytokines in inpaired spinal cord(pg/ml，，n=5)

Tab.2 Change of inflammation cytokines in inpaired spinal cord(pg/ml，，n=5)

HBO:Hyperbaric oxygen*P＜0.05，**P＜0.01 vs false injury group;#P＜0.05 vs model group

Group TNF-α IL-6 IFN-γ False injury 45.18±7.21 78.92±17.23 26.59±4.23 Model 121.67±4.76**157.45±11.34*106.73±5.93**HBO 87.32±6.98# 98.95±10.21#87.39±6.38#

3 討論

炎癥在脊髓損傷的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用，局部損傷組織的炎性反應(yīng)可加重繼發(fā)性脊髓損傷的程度[2]。局部損傷后引起的繼發(fā)性炎性環(huán)境會(huì)促使損傷脊髓處的細(xì)胞發(fā)生壞死和凋亡，而出現(xiàn)不可逆性的病理改變，從而加重脊髓損傷。Trivedi等報(bào)導(dǎo)中性粒細(xì)胞可通過(guò)向損傷部位聚集，釋放彈性蛋白酶等物質(zhì)，加重組織水腫、壞死、促進(jìn)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致局部出現(xiàn)膠質(zhì)瘢痕[3]。本研究中發(fā)現(xiàn)，在損傷后14天，局部損傷組織中炎癥因子:TNF-α、IL-6、IFN-γ的含量顯著增高。

高壓氧長(zhǎng)期以來(lái)廣泛用于脊髓損傷的治療，HBO可迅速糾正損傷組織的缺氧狀態(tài)，使缺血組織的血流加快、血管擴(kuò)張、微循環(huán)障礙得到糾正，從而可有效清除自由基，抑制氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化[4]。HBO可通過(guò)對(duì)單核-巨噬細(xì)胞前致炎性因子的合成抑制，達(dá)到抗炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)作用[5]。

本研究中發(fā)現(xiàn)采用HBO治療脊髓損傷的大鼠后，在治療后2周，治療組大鼠的BBB評(píng)分顯著上升，和模型組比較具有顯著的差異性，證明高壓氧對(duì)脊髓損傷具有一定的干預(yù)性。同時(shí)局部脊髓組織勻漿后，經(jīng)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)炎癥因子顯著下降，證實(shí)HBO可通過(guò)拮抗局部損傷組織的炎癥反應(yīng)，達(dá)到免疫調(diào)節(jié)的作用，從而抑制炎癥因子引起的脊髓繼發(fā)性損傷，改善局部的神經(jīng)恢復(fù)。

因?yàn)槊庖哐仔苑磻?yīng)在脊髓損傷早期異?；钴S，并在繼發(fā)性脊髓損傷中扮演著重要的角色。通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)中脊髓損傷2周時(shí)損傷局部炎性因子的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)HBO及時(shí)的早期干預(yù)可有效抑制損傷部位的免疫炎性反應(yīng)，因此HBO對(duì)脊髓損傷早期救治起著重要作用。

[1]Basso D M，BeattieM S，Bresnahan J C.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats[J].J Neurotrauma，1995，12(1):1-21.

[2]Beattie M S.Inflammation and apoptosis:linked therapeutic targets in spinal cord injury[J].Trends Mol Med，2004，10(12):580-583.

[3]Trivedi A，Olivas A D.Noble-haensslein L.Inflammation and Spinal Cord Injury:Infiltrating Leukocytes as Determinants of Injury and Repair Processes[J].Clin Neurosci Res，2006，6(5):283-292.

[4]Al-Waili N，Butler G S，Beale J，et al.Hyperbaric oxygen in the treatment of patients with cerebral stroke，brain trauma，and neurologic disease[J].Adv Ther，2005，22(6):659-678.

[5]Milovanova T N，Bhopale V M，Sorokina E M.Hyperbaric oxygen stimulates vasculogenic stem cell growth and differentiation in vivo[J].J Appl Physiol，2009，106(2):711-728.