(遼寧醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，遼寧錦州121001)

近年來研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素對(duì)多種惡性腫瘤具有良好的抗癌功效，而在抗腎癌方面的相關(guān)報(bào)道較少。2010年3月～2011年9月，我們觀察了槲皮素對(duì)腎癌786-0細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 腎癌786-0細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生化細(xì)胞所細(xì)胞庫，并經(jīng)傳代培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;槲皮素，用 DMSO溶解配制成原液，－20℃保存;MTT，Annexin V/PI染色試劑盒，磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、Akt及 β-actin;細(xì)胞培養(yǎng)箱(NAPCO MODEL5410)，低溫高速離心機(jī)(Ependorff，美國)，流式細(xì)胞測(cè)定儀(Becton-Dickinson，美國)。

1.2 方法

1.2.1 槲皮素對(duì)786-0細(xì)胞增殖影響的觀察 采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以2×103/孔接種96孔板，培養(yǎng)24 h;待細(xì)胞貼壁后，觀察組分別加入終濃度分別為10、25、50、100μmol/L的槲皮素，對(duì)照組加入1‰的DMSO，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24、48、72 h后，加入5 mg/mL的 MTT 10μL;培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，加入0.1 mL DMSO;待結(jié)晶完全溶解后，在Bio-Rad550酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上以570 nm和630 nm雙波長(zhǎng)測(cè)定每孔的吸光度(A)值。細(xì)胞增殖抑制率=(1－觀察組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.2.2 槲皮素對(duì)786-0細(xì)胞凋亡影響的觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。細(xì)胞接種同1.2.1，待細(xì)胞貼壁后，觀察組加入終濃度分別為10、25、50μmol/L槲皮素，對(duì)照組加入1‰的DMSO，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞，加入適量PBS，2 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)2次。加入500μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，再加入5μL Annexin V混勻后，加入5μL PI，混勻;室溫、避光反應(yīng)15 min后，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 槲皮素對(duì)786-0細(xì)胞p-Akt及總Akt蛋白表達(dá)影響的觀察 細(xì)胞接種、分組及處理同1.2.2，培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞，采用Wester blot法檢測(cè)，按說明書進(jìn)行。p-Akt(總Akt)表達(dá)量=［(實(shí)驗(yàn)組p-Akt(總 Akt)/實(shí)驗(yàn)組 β-actin］/［對(duì)照組 p-Akt(總Akt)/對(duì)照組 β-actin］。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對(duì)786-0細(xì)胞增殖的影響 槲皮素對(duì)腎癌786-0細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用呈現(xiàn)明顯時(shí)間及劑量依賴性(P 均 ＜0.05)，見表1。

2.2 槲皮素對(duì)786-0細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組及觀察組經(jīng)10、25、50μmol/L的槲皮素處理后，786-0細(xì)胞凋亡率分別為 3.16% ±1.78%、13.4% ±3.87%、22.38% ± 2.44%、34.42% ± 5.37%，觀察組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比明顯增加(P均＜0.05)，且隨劑量升高而增加。

表1 槲皮素對(duì)腎癌786-0細(xì)胞增殖抑制率的影響(±s)

表1 槲皮素對(duì)腎癌786-0細(xì)胞增殖抑制率的影響(±s)

槲皮素(μmol/L)細(xì)胞增殖抑制率(%)24 h 48 h 72 h 10 88.95 ±3.14 85.41 ±4.78 75.47 ±6.31 25 77.73 ±6.67 64.53 ±5.75 37.56 ±7.75 50 70.72 ±6.58 51.86 ±4.12 24.83 ±8.56 100 66.51 ±8.79 44.98 ±4.67 19.87 ±6.55

2.3 槲皮素對(duì)786-0細(xì)胞內(nèi)p-Akt和總Akt表達(dá)的影響 10、25、50μmol/L的槲皮素處理48 h后，786-0細(xì)胞 p-Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.92±0.05、0.54 ±0.06、0.33 ±0.04，總 Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.03 ±0.08、0.93 ±0.12、0.54 ±0.06。不同濃度槲皮素處理后786-0細(xì)胞內(nèi)p-Akt表達(dá)水平比較，P 均 ＜0.05。

3 討論

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，廣泛分布于植物、食物及中草藥之中。近年來研究表明，槲皮素具有調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的作用。王旭等［1］將體外培養(yǎng)的卵巢癌HO-8910細(xì)胞用不同濃度的的槲皮素處理，發(fā)現(xiàn)槲皮素能抑制HO-8910細(xì)胞的增殖，并呈時(shí)間和劑量依賴性(P均＜0.05)。趙旭林等［2］研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可顯著抑制肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，提示誘導(dǎo)凋亡為槲皮素抑癌的機(jī)制之一。馬朋等［3］研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，且呈濃度和時(shí)間依賴性。經(jīng)槲皮素作用48 h后，AO/EB雙重染色可見細(xì)胞呈凋亡樣改變;槲皮素作用Hela細(xì)胞24、48 h后，與對(duì)照組相比線粒體膜電位下降，此結(jié)果提示槲皮素能體外抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外研究［4，5］發(fā)現(xiàn)，槲皮素能顯著抑制人鼻咽癌 CNE2 細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。槲皮素抗腫瘤作用具有選擇性，對(duì)正常細(xì)胞的毒性微弱［6］，因此是一種較為理想的抗腫瘤藥物，其制劑已進(jìn)入Ⅰ期臨床研究階段［7］。本研究結(jié)果表明，槲皮素能夠有效地抑制腎癌786-0細(xì)胞增殖，其抗腫瘤作用主要是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)于槲皮素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，目前尚不清楚。研究表明，PI3K/Akt通路是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控增殖與凋亡的重要傳導(dǎo)通路。其中Akt位于PI3K的下游，活化后可磷酸化其下游靶蛋白，進(jìn)而促進(jìn)一系列細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞快速增殖［8］。龐瑞萍等［9］研究發(fā)現(xiàn)，吲哚美辛可能通過Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MGC-803的凋亡。張敏等［17］應(yīng)用脫氧核酶抑制Akt表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Akt脫氧核酶對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)具有抑制作用。Hara等［11］研究發(fā)現(xiàn)，與正常腎組織相比，腎癌組織中p-Akt表達(dá)顯著升高，提示應(yīng)用Akt抑制劑可誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，786-0細(xì)胞在靜息狀態(tài)下即存在PI3K/Akt通路的活化，以槲皮素處理后PI3K/Akt通路活性明顯下降，提示槲皮素可能通過抑制PI3K/Akt通路活性發(fā)揮對(duì)腎癌的抗腫瘤作用。下一步作者將使用大鼠進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究槲皮素對(duì)于體內(nèi)實(shí)體腫瘤的抑癌作用。

［1］王旭，張爽.槲皮素對(duì)卵巢癌細(xì)胞HO-8910增殖的抑制作用及機(jī)制［J］.山東醫(yī)藥，2010，50(6):14-16.

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［3］馬朋，宋曉冬，閆苗苗，等.槲皮素誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的作用［J］.解剖學(xué)雜志，2011，34(4):462-465.

［4］楊娜，朱開梅，顧生玖.槐米中槲皮素對(duì)人鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖與凋亡作用的研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22(9):2215-2217.

［5］高薇，劉洪，孫靜.槲皮素誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究［J］.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，32(6):849-851.

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