李常挺，李 軍，覃俊江，楊 威，陳澤祥，趙 武

（1.廣西隆安縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 隆安 532700；2.廣西獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001；3.廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001；4.隆安縣水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局，廣西 隆安 532700）

廣西黑山羊是我國(guó)肉用山羊品種之一，具有被毛全黑、適應(yīng)性強(qiáng)、肉質(zhì)鮮嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富等優(yōu)良特性。布魯氏菌病是由布魯氏菌屬細(xì)菌引起的人畜共患傳染病，其主要特征是生殖器官和胎膜發(fā)炎，引起流產(chǎn)、不育[1]。廣西自50年代發(fā)生布魯氏菌病疫情以來主要以豬布魯氏菌病為主，牛和羊基本無疫情[2-3]。2000年以后，由于規(guī)?；B(yǎng)殖步伐加快、家畜流動(dòng)性大增，不少農(nóng)戶陸續(xù)從外省引進(jìn)牛羊飼養(yǎng)，但是他們對(duì)《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》和《種畜禽管理?xiàng)l例》缺乏了解，沒有申報(bào)就盲目私自從外省購(gòu)買家畜，2002年牛種布魯氏菌病疫情和2004年羊種布魯氏菌病疫情就是通過無序引種的方式引入廣西[4-5]。最近隆安縣某黑山羊養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的黑山羊多次出現(xiàn)流產(chǎn)和死胎，流產(chǎn)多發(fā)生于黑山羊懷孕后的3～4個(gè)月，近半年內(nèi)整個(gè)羊群母羊流產(chǎn)達(dá)到60%。經(jīng)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，證實(shí)該群黑山羊感染羊種布魯氏菌病。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 該羊群血清10份（公畜血清1份，母畜血清9份）；流產(chǎn)死胎2只。

1.1.2 主要試劑和儀器 布魯氏菌液體培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司，胰蛋白示購(gòu)自英國(guó)Oxiod公司，馬血清購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，布魯氏菌虎紅凝集抗原和凝集試管抗原購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司。PCR Taq Mix、DNA Marker 2購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，PCR儀購(gòu)自日本TaKaRa公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Alpha Inotech公司。

1.2 方法

1.2.1 血清學(xué)檢測(cè) 首先使用虎紅平板凝集試驗(yàn)對(duì)黑山羊血清進(jìn)行布魯氏菌病陽性抗體的初篩，陽性血清再按照《布氏病試管凝集試驗(yàn)（GB/T18646）》進(jìn)行確認(rèn)[6]。

1.2.3 細(xì)菌分離 將流產(chǎn)胎兒先用無菌生理鹽水清洗干凈，然后放在3%的來蘇兒水中浸泡30 min，取出在無菌條件下進(jìn)行解剖，取淋巴結(jié)、肝、脾、肺、心血等病料分別接種5%馬血清胰蛋白示培養(yǎng)基上，置5%二氧化碳培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)7 d，觀察培養(yǎng)基上細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.2.4 布魯氏菌的PCR鑒定 應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)基上濕潤(rùn)、光滑、圓形、革蘭氏染色為陰性小桿菌的細(xì)菌基因組DNA，按陳澤祥等建立的PCR檢測(cè)方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行布魯氏菌的PCR鑒定[7]。使用AMOS-PCR方法進(jìn)行布魯氏菌種型的PCR鑒定[8]。以羊種布魯氏菌5號(hào)疫苗為陽性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 布魯氏菌抗體檢測(cè) 布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果表明，所檢10份黑山羊血清全部出現(xiàn)陽性反應(yīng)。對(duì)這10份黑山羊血清進(jìn)行布魯氏菌試管凝集試驗(yàn)，結(jié)果有8份山羊血清（1頭公羊和7頭母羊）呈布魯氏菌抗體陽性反應(yīng)。

2.3 細(xì)菌分離培養(yǎng) 流產(chǎn)胎兒淋巴結(jié)、肝、脾、肺、心血接種的培養(yǎng)基在培養(yǎng)到48 h時(shí)，均看見有細(xì)菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)到72 h觀察到白色、圓形突起、針尖大小的菌落。將菌落抹片、火焰固定，革蘭氏染色顯微鏡觀察細(xì)菌呈紅色、單個(gè)排列、球狀。在清潔無油脂的玻片上，一端滴一滴滅菌生理鹽水，一端滴一滴從中國(guó)獸醫(yī)監(jiān)察所購(gòu)買的布魯氏桿菌病陽性血清，然后用接種環(huán)取少量菌落分別放入生理鹽水和陽性血清內(nèi)，輕輕研磨、混勻，觀察凝集情況。結(jié)果生理鹽水不凝集，陽性血清內(nèi)有沙粒狀的凝集反應(yīng)。說明分離的細(xì)菌為光滑型布氏桿菌。

2.4 細(xì)菌的PCR鑒定 按陳澤祥等建立的PCR檢測(cè)方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行布魯氏菌的PCR鑒定，PCR產(chǎn)物電泳出現(xiàn)布魯氏菌193 bp的目的條帶（圖1），可確定該細(xì)菌為布魯氏菌。

利用AMOS-PCR對(duì)分離的布魯氏菌進(jìn)行種型鑒定，PCR電泳結(jié)果顯示在731 bp處出現(xiàn)目的條帶（圖2），將PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果為羊種布魯氏菌，可以確定分離布氏菌為羊種布氏桿菌。

2.5 疫情的處理 根據(jù)黑山羊的臨床癥狀、血清學(xué)診斷和流產(chǎn)胎兒分離細(xì)菌鑒定結(jié)果，確定該病例為羊種布魯氏菌病。結(jié)果確定后立即根據(jù)農(nóng)業(yè)部《布魯氏菌病防治技術(shù)規(guī)范》（農(nóng)醫(yī)發(fā)[2007]12號(hào)）啟動(dòng)疫情處理程序：縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所下文，立即進(jìn)行全群撲殺，無害化處理；對(duì)羊欄、場(chǎng)地和污染物進(jìn)行了嚴(yán)格消毒，并對(duì)同村飼養(yǎng)的山羊、種豬、牛進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)布魯氏菌病病畜。

3 討論

近年來廣西山羊也曾檢測(cè)出過布魯氏菌血清抗體陽性羊，但沒有分離出布氏菌。此次在廣西黑山羊血清中檢測(cè)到布氏菌抗體陽性，流產(chǎn)胎兒分離出羊種布魯氏菌，說明廣西山羊也面臨著布魯氏菌病的嚴(yán)重威脅。家畜飼養(yǎng)量劇增、種畜調(diào)運(yùn)頻繁、流通環(huán)節(jié)檢疫監(jiān)管工作難度大及缺乏防范意識(shí)等因素是導(dǎo)致廣西出現(xiàn)山羊布魯氏菌病的主要原因。為有效防治布魯氏菌病的發(fā)生流行，建議應(yīng)加強(qiáng)領(lǐng)導(dǎo)，加大防治經(jīng)費(fèi)投入，將防治工作納入長(zhǎng)期發(fā)展規(guī)劃；強(qiáng)化檢疫監(jiān)督執(zhí)法，重點(diǎn)加強(qiáng)產(chǎn)地檢疫工作和引種申報(bào)工作，對(duì)未經(jīng)報(bào)批擅自引種和依法應(yīng)當(dāng)檢疫而未經(jīng)檢疫等違法違規(guī)行為進(jìn)行嚴(yán)厲處罰；建立健全撲殺動(dòng)物補(bǔ)償制度，對(duì)檢測(cè)出陽性病畜要堅(jiān)決予以撲殺無害化處理；各部門要加強(qiáng)協(xié)作，密切配合，并營(yíng)造良好的防疫氛圍，促使全社會(huì)共同參與，努力從動(dòng)物源頭上控制布魯氏菌病的發(fā)生流行，有力保障畜牧業(yè)的快速發(fā)展與維護(hù)人民群眾的身體健康。

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