杜雄偉，李 葉，胡傳偉

（1.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，大連 16600；2.遼寧出入境檢驗檢疫局，大連 116001）

近幾年隨著國內(nèi)外市場對裘皮需求的增長以及國外相關(guān)行業(yè)向國內(nèi)的轉(zhuǎn)移，國內(nèi)水貂、狐貍、狍子等毛皮動物的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展極為迅速，據(jù)報道，目前我國水貂的飼養(yǎng)量達到800萬頭，從國外引進水貂良種的貿(mào)易也越來越頻繁。由于經(jīng)濟動物養(yǎng)殖的高度集約化、規(guī)?；c小規(guī)模散養(yǎng)以及作伴侶動物并存特點。水貂阿留申病（AD）和犬細小病毒?。–P）是危害皮毛經(jīng)濟動物的兩種重要疫病。傳染性疾病的暴發(fā)流行，造成很大的經(jīng)濟損失；同時這幾種經(jīng)濟動物傳染病也是犬、貓和水貂、狐貍、狍子等多種經(jīng)濟動物進出境時的主要檢疫對象，開展這些傳染病病原的快速診斷方法的研究，對經(jīng)濟動物疫情的快速診斷與控制、加強經(jīng)濟動物及其產(chǎn)品進出境的檢驗檢疫工作，御疫情于國門之外有重要的意義[1-2]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 水貂阿留申病毒（ADV）、犬細小病毒（CPV）本實驗室自行保存。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計

通過DNAStar5.0軟件對基因庫中ADV、CPV的保守區(qū)域序列進行分析，應(yīng)用Primer premier5.0軟件設(shè)計特異性引物，均由寶生物（大連）有限公司合成，序列如下：

ADV s 5' AAGCCATTACTGGAGGTGGTGAT 3'；ADV x 5' CATGCCGAGGTCTCTTGTGC 3' 預(yù)計擴增產(chǎn)物536 bp。

CPVs： 5' ATTGGGCTTACCGCCATTTC 3’；CPVx： 5' TATCTTCCCGTATCTTGATGTGCT 3’預(yù)計擴增產(chǎn)物375 bp。

1.2.2 病毒RNA/DNA的提取

照寶生物MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.2.0試劑盒說明書進行。

1.2.3 復(fù)合PCR檢測方法的擴增

取上述抽提病毒DNA液10 μL加入10×PCRbuffer 2.5 μL，各對引物分別0.5 μL，DNA Taq酶0.5 μL，dNTP（2.5mm）1.0 μL，水9 μL。94 ℃ 3 min，一個循環(huán)；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；12 ℃保存。

由于駕駛艙發(fā)生破孔瞬間，從孔口流出的氣體速度非?？欤^程進行的時間很短，可以將氣流從孔口流出視為一維等熵流動，其伯努利方程為：

1.2.4 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.2.4.1 MgC12濃度的調(diào)整 采用5個濃度梯度對MgC12濃度進行調(diào)整，即1 μmol／L、2 μmol／L、3 μmol／L、4 μmol／L、5 μmol／L。

1.2.4.2 退火溫度的調(diào)整 根據(jù)設(shè)計的引物，運用公式T一2（A4-T）4-4（G4-C）計算退火溫度 ，再按照實際情況，確定PCR反應(yīng)中的限溫度為58 ℃，然后進行一個梯度PCR反應(yīng)（梯度為55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃、59 ℃、60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃）。

1.2.4.3 Taq酶、循環(huán)次數(shù)、變性溫度、變性時間、延伸溫度、延伸時間等諸項進行調(diào)整。

1.2.5 擴增的特異性試驗

分別用上述引物對對水貂阿留申病毒、犬細小病毒、犬肝炎病毒、犬冠狀病毒分離株做PCR進行特異性試驗。

1.2.6 PCR擴增的敏感性試驗

以10倍系列稀釋法對CDV、CPV、ADV提取的RNA/DNA液進行稀釋，分別作為PCR模板，用上述試驗確定的最佳PCR反應(yīng)條件進行多重PCR擴增，取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，檢測該方法的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合PCR檢測方法的建立

復(fù)合PCR擴增（圖1）結(jié)果，有明顯目的條帶的出現(xiàn)，即ADV為536 bp，CPV為375 bp。后經(jīng)測序證實該序列為目的序列，表明該方法可同時區(qū)分這兩種病毒。

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化

MgC12在3 μmol／L或4 μmol／L時有特異性條帶產(chǎn)生。當(dāng)退火溫度低于56 ℃時，有非特異性條帶產(chǎn)生，當(dāng)高于65 ℃時無條帶產(chǎn)生，在55 ℃時條帶最亮。只要遵循PCR反應(yīng)基本條件，其他因素對PCR反應(yīng)的敏感性和特異性影響不大。

2.3 特異性和敏感性

各對引物均能擴增出對應(yīng)目的條帶，沒有產(chǎn)生雜帶，表明該引物比較特異。用紫外分光光度計測得提取的CPV和ADV的DNA的濃度為86 ng/μL和95 ng/μL。將模板DNA作10倍系列稀釋，取不同稀釋度的模板DNA各5 μL分別進行PCR擴增，結(jié)果105稀釋的模板仍能擴增出目的條帶，106稀釋的模板僅能擴增出375 bp的單帶，不能擴增出536 bp條帶，表明復(fù)合PCR擴增檢測到4.3 Pg的ADV模板DNA及0.475 Pg的CPV模板DNA。

3 討論

水貂阿留申?。ˋleutian disease of mink，AD）是由水貂阿留申病毒（ADV）感染水貂引起的以終生毒血癥、全身淋巴細胞增殖、血清γ-球蛋白增多、腎小球腎炎、動脈血管炎和肝炎為特征的一種慢性病毒病。本病在世界各養(yǎng)貂國家均有發(fā)生，所有品系的水貂均能感染，具有阿留申基因型的水貂死亡率可達30%。本病還能使母貂空懷率和仔貂死亡率顯著升高，公貂的交配能力下降，還能影響發(fā)育而使毛皮品質(zhì)低下，造成經(jīng)濟損失，是世界上公認的養(yǎng)貂的重大疫病之一[3-7]。犬細小病毒感染是1978年由美國首先發(fā)現(xiàn)，我國也有發(fā)生。本病只見于犬科動物，幼犬特別易感，引起腸炎和心肌炎，發(fā)病率20%～100%，致死率10%～50%，4 周齡以內(nèi)死亡率最高[9-14]。

在建立復(fù)合PCR的檢測方法時，引物設(shè)計至關(guān)重要，引物長度、G+C含量、Tm值應(yīng)盡量一致，且各擴增片段大小要適宜，既要避免電泳不能分辨，又不能相差過大。本研究設(shè)計的3對引物GC含量相近，Tm值相近，這就保證了在相同的退火溫度下，CDV、CPV和ADV都能得到很好擴增。其擴增片段分別為375 bp、536 bp，這使得在檢測時能在同一個電泳膠上進行鑒定，為復(fù)合PCR方法的成功建立奠定了基礎(chǔ)[15-17]。

CPV傳統(tǒng)上主要依靠病毒的分離鑒定，而ADV主要通過免疫電泳進行鑒定，這些方法費時費力。而PCR技術(shù)具有簡便、快速、靈敏度高等優(yōu)點。本研究建立的PCR方法顯示，無論是單一PCR還是多重PCR，均能擴增出CPV和 ADV特異性條帶，其最小檢測濃度為0.5 ng，且對犬肝炎病毒、犬冠狀病毒分離株均不起反應(yīng)，表明建立的方法具有很強的特異性和高度的敏感性。我們用建立的方法對CPV和ADV的混合樣品進行檢測，結(jié)果與預(yù)期相符，能夠特異性的檢測到這2種病毒，表明建立的方法可以用于CPV和 ADV的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

[1]王信喜，楊海明，王慶，等.特種經(jīng)濟動物養(yǎng)殖的現(xiàn)狀與思考[J].特種經(jīng)濟動植物，2010（6）：5-7.

[2]王奔，張宏玲，馮樹利，等.我國特種經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)存在的問題與對策[J].當(dāng)代畜牧，2009（10）：1-3.

[3]Porter D D， Larsen A E， Porter H G. Aleutian disease of mink[J]. Adv Immunol ，1980，29（1）：261-286.

[4]張慶明，王玉平，雷連成，等.水貂阿留申病研究進展[J].河北科技師范學(xué)院學(xué)報，2005，25（4）：45-47.

[5]李艷伍，張瑞，姜平，等.水貂阿留申病病毒分子生物學(xué)研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2009，30（9）：100-104.

[6]Best S M ，Wolf i nbarger J B， Bloom M E. Caspase activation is required for permissive replication of Aleutian mink disease.pavovirus in vitro[J]. Virology，2002，292（2）：224-234.

[7]Aslanidis S，Pyrpasopoulou A， Kont otasios K，et al.Parvovirus B19 infection and systemic lupus erythemaosus：Activation of an aberrant pathway[J]. Euro J Inter Med，2008，19（5）：314-318.

[8]Qiu J，Cheng F，Burger L R，et al.The transeription protile ofAleutian mink disease virus（AMDV） in CRFK cells is generated by alternative processing of pre-mRNAs produced from a single promoter[J]. J Virol，2006，80（2）：654-662.

[9]趙建軍，閆喜軍，吳威.犬細小病毒：從起源到進化[J].微生物學(xué)報，2011，51（7）：869-875.

[10]Shackelton LA，Parrish CR，Truyen U，et al. High rate of viral evolution associated with the emergence of carnivore parvovirus[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102（2）：379-384.

[11]Hoelzer K，Shackelton LA，Parrish CR.Presence and role of cytosine methylation in DNA viruses of animals[J].Nucleic Acids Research，2008，36（9）：2825-2837.

[12]Nakamura K，Sakamoto M，Ikeda Y，et al. Pathogenic potential of canine parvovirus types 2a and 2c in domestic cats[J].Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology，2001，8 （3）：663-668.

[13]Mochizuki M，Ohshima T，Une Y，Yachi A.Recombination between vaccine and fi eld strains of canine parvovirus is revealed by isolation of virus in canine and feline cell cultures[J].The Journal of Veterinary Medical Science，2008，70（12）：1305-1314.

[14]Kapil S，Rezabek G，Germany B，et al. Isolation of a virus related to canine parvovirus type 2 from a raccoon（ Procyon lotor）[J].Veterinary Record，2010，166（1）：24-25.

[15]劉大飛，姜一曈，楊天闊，等.同時檢測犬瘟熱病毒和犬細小病毒雙重PCR方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2012，34（3），211-213.

[16]Mech L D，Almberg E S，Smith D，et al. Use of Real-time PCR to Detect Canine Parvovirus in Feces of Free-ranging Wolves[J]. J Wildl Dis，2012，48（2）：473-476.

[17]Jensen T H， Christensen L S， Chriél M，et al. Implementation and validation of a sensitive PCR detection method in the eradication campaign against Aleutian mink disease virus[J]. J Virol Methods，2011，171（1）：81-85.