楊 琳

（萬源市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 萬源 636350）

四環(huán)素類藥物（TCs）具有廣譜抗生活性，有良好的殺菌抑菌作用，不僅對(duì)革蘭氏陽性，革蘭氏陰性和支原體，甚至對(duì)立克次體和衣原體之類的微生物都有活性[1]。價(jià)格便宜，經(jīng)常作為飼料添加劑用于畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖中，常見的TCs包括四環(huán)素（Tetracycline，TC）、土霉素（Oytetracycline，OTC）、金霉素（chlortetracycline，CTC）和強(qiáng)力霉素（Doxycycline，DC）[2]。近年來，為有效預(yù)防和治療畜禽、魚類的疾病，獸藥及化學(xué)藥品被廣泛地應(yīng)用做飼料添加劑，以促進(jìn)其生長(zhǎng)速度，控制其生殖周期和繁育能力。土霉素、金霉素和四環(huán)素是我國(guó)應(yīng)用最廣、應(yīng)用時(shí)間最長(zhǎng)的動(dòng)物保健性抗生素，一些不法分子為了經(jīng)濟(jì)效益，常濫用這類藥物，致使在動(dòng)物性食品中大量殘留，不僅危害人體健康，而且更為嚴(yán)重的是畜禽產(chǎn)品中殘留較低濃度的土霉素、金霉素和四環(huán)素容易誘導(dǎo)各種致病菌產(chǎn)生耐藥性，不利于對(duì)人類和畜禽類疾病的治療[3-5]。世界糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織、歐盟及我國(guó)等都對(duì)畜禽產(chǎn)品中土霉素、金霉素和四環(huán)素的殘留做出了嚴(yán)格的規(guī)定。因此，控制土霉素、金霉素和四環(huán)素的使用，實(shí)施對(duì)畜禽產(chǎn)品中土霉素、金霉素和四環(huán)素及有害代謝產(chǎn)物殘留的檢測(cè)分析十分重要。本文就目前畜禽產(chǎn)品中土霉素、金霉素和四環(huán)素的殘留分析方法的新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 土霉素、金霉素和四環(huán)素的危害

土霉素、金霉素和四環(huán)素都屬于四環(huán)素類抗生素，常用于防止禽畜病害，促進(jìn)幼年禽畜生長(zhǎng)等。隨著TCs在畜禽養(yǎng)殖中的廣泛應(yīng)用，濫用藥的情況時(shí)有發(fā)生，其殘留問題也引起了人們的高度關(guān)注。長(zhǎng)期食用含有抗生素的食品將對(duì)人們的健康造成極大危害，引起骨骼畸形和生長(zhǎng)抑制，干擾人體的正常生理機(jī)能，影響兒童和青少年的生長(zhǎng)發(fā)育，降低人體對(duì)致病菌的抵抗能力，并可造成肝腎損害，引起前庭反應(yīng)、過敏反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)、耐藥性等[6]。

2 土霉素、金霉素和四環(huán)素的限量標(biāo)準(zhǔn)

隨著人們生活水平的提高，食品安全問題日益受到廣泛關(guān)注，獸藥殘留問題也引起高度重視。土霉素、金霉素和四環(huán)素在畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛，在畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展中發(fā)揮了重大作用，但是一些不法分子濫用四環(huán)素類抗生素，造成其在畜禽產(chǎn)品中大量殘留，因此，一些國(guó)家和地區(qū)紛紛建立了土霉素、金霉素和四環(huán)素的限量標(biāo)準(zhǔn)（表1）。

表1 部分國(guó)家和地區(qū)限量標(biāo)準(zhǔn)

3 土霉素、金霉素和四環(huán)素檢測(cè)方法

3.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法及分子排阻色譜法。HPLC是目前常用于獸藥殘留檢測(cè)的方法，可進(jìn)行定性和定量分析，并可配套使用不同的萃取、提純及柱前、后衍生和靈敏的檢測(cè)系統(tǒng)，主要有紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、示差檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器以及安培計(jì)。李月歡等[7]建立超高效液相色譜—電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜快速測(cè)定畜、禽肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素的方法。土霉素、四環(huán)素、金霉素的最低檢出限分別為0.1、0.1、0.5 μg/kg，在5.0～80.0 ng/L的線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，回收率82.6%～111%。智若嵐等[8]建立了測(cè)定豬肉組織中土霉素及金霉素殘留量HPLC法，土霉素、金霉素標(biāo)準(zhǔn)品分別在0.1～1.0 μg/mL、0.2～2.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；土霉素在3個(gè)不同濃度添加水平的回收率為78.06%～87.21%，變異系數(shù)為3.02%～7.72%；金霉素的回收率為76.45%～85.62%，變異系數(shù)為3.46%～6.32%。土霉素及金霉素的最低檢出線分別為20 μg/kg和10 μg/kg（表2）。

表2 高效液相色譜法檢測(cè)土霉素、金霉素和四環(huán)素

HPLC用于真菌毒素檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，靈敏度、分辨率高，重現(xiàn)性好，樣品需要量少，溶劑用量少，能把同時(shí)分離多種物質(zhì)，適用于四環(huán)素類獸藥殘留的精準(zhǔn)檢測(cè)；但由于其設(shè)備昂貴、對(duì)樣品中樣品純度的要求較高、前處理復(fù)雜、建立方法比較困難，導(dǎo)致檢測(cè)成本高、周期長(zhǎng)，無法滿足大批量樣本快速篩查的需要，因而使用受到限制。

3.2 免疫學(xué)方法

免疫學(xué)分析法是以抗原抗體的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)進(jìn)行抗原抗體含量測(cè)定的方法，它具有高度的特異性、靈敏性和快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。用于土霉素、金霉素和四環(huán)素檢測(cè)的免疫學(xué)方法主要有酶聯(lián)免疫法（ELISA）和膠體金免疫層析技術(shù)。

邢淑婕等[22]采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析了自制抗土霉素抗體的靈敏度與特異性，結(jié)果表明，所得抗體的靈敏度和特異性都較好，與其它結(jié)構(gòu)相似或相近物質(zhì)的交叉反應(yīng)率較低；同時(shí)對(duì)蜂蜜中土霉素的提取方法進(jìn)行了研究，得出了最佳提取方法和條件；檢測(cè)范圍為5～200 ng/mL，相關(guān)系數(shù)r為0.9951，在此范圍內(nèi)對(duì)人工污染樣品的平均回收率為97.5%～107.0%。劉智宏等[23]構(gòu)建了一種四環(huán)素類藥物殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，試劑盒的最低檢測(cè)限為0.3 μg/L，檢測(cè)范圍為0.3～30 μg/L，可同時(shí)測(cè)定獸醫(yī)常用的四環(huán)素、金霉素、土霉素和多西環(huán)素4種藥物殘留，靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度均能滿足獸藥殘留檢測(cè)要求。邢淑婕等[24]以自制抗體建的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)牛奶中土霉素的殘留進(jìn)行了檢測(cè)，所建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法對(duì)土霉素的檢測(cè)范圍為5～200 ng/mL，相關(guān)系數(shù)為0.9951。付云潔等[25]研究了食品中金霉素殘留的膠體金免疫層析法的快速檢測(cè)方法，試紙條法的金霉素檢測(cè)限為0.7 μg/mL，檢測(cè)時(shí)間僅需5 min。林杰等[26]探討應(yīng)用ROSA法同時(shí)快速檢測(cè)UHT奶中的四環(huán)素類和β—內(nèi)酰胺類藥物殘留，驗(yàn)證了ROSA法的檢測(cè)靈敏度、特異性和穩(wěn)定性，10 min可出檢測(cè)結(jié)果。檀尊社等[27]建立用于快速檢測(cè)水產(chǎn)樣品中四環(huán)素類藥物殘留含量的膠體金免疫層析檢測(cè)試劑，試劑靈敏度最低值可達(dá)100 ng/mL，僅需5～10 min，與金霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素等四環(huán)索族抗生素有很強(qiáng)的交叉反應(yīng)。武玉香等[28]研究了斑點(diǎn)金免疫滲濾法快速檢測(cè)禽肉中金霉素殘留，方法的檢測(cè)限為0.4 μg/mL，在金霉素濃度為0.6～μg/mL范圍內(nèi)可實(shí)現(xiàn)定量分析。免疫學(xué)方法用于金霉素、土霉素和四環(huán)素檢測(cè)，靈敏，簡(jiǎn)便，快速，特異性強(qiáng)，對(duì)樣品中凈化純度要求不高，能同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品定性或定量檢測(cè)，適于獸藥殘留的批量檢測(cè)，但檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性差，酶穩(wěn)定性差，試劑壽命短，而且由于存在交叉反應(yīng)而易造成假陽性，使復(fù)雜樣品受干擾，因此需要用其它的方法來驗(yàn)證。適用于樣品的定性篩選檢測(cè)。

3.3 其他檢測(cè)方法

少數(shù)研究表明毛細(xì)管電泳法、微生物學(xué)法也可用于土霉素、金霉素和四環(huán)素的檢測(cè)。邢曉平[29]運(yùn)用毛細(xì)管電泳—電化學(xué)檢測(cè)法對(duì)雞蛋中殘留的四環(huán)素、土霉素進(jìn)行快速測(cè)定分析。TC和OTC的線性范圍分別為2.0×10-6～5.0×10-4g/mL、8.0×10-6～3.0×10-4g/mL，檢出限分別為1.9×10-8g/mL、4.1×10-8g/mL。陳樹橋等[30]建立了一種相對(duì)簡(jiǎn)便有效的微生物法檢測(cè)青蝦肌肉組織中土霉素的殘留。在0.32～5.12 μg/mL的土霉素濃度范圍，線形關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999。在青蝦肌肉中的最低檢出限是2.0 μg/kg，通過與HPLC對(duì)比并經(jīng)t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)2種方法檢測(cè)結(jié)果沒有顯著性差異。毛細(xì)管電泳法檢測(cè)四環(huán)素類藥物殘留不需要過柱等繁瑣的預(yù)處理過程，方法簡(jiǎn)便、易操作。微生物學(xué)方法操作簡(jiǎn)便、具有一定的靈敏度，特別在大批量樣品分析中具有很大優(yōu)勢(shì)[31]。

4 小結(jié)與展望

食品中獸藥殘留嚴(yán)重影響公共健康，獸藥殘留的檢測(cè)引起了人們的高度重視。土霉素、金霉素和四環(huán)素作為常用的動(dòng)物用藥，其殘留問題已較普遍，其檢測(cè)方法已經(jīng)建立。目前，在土霉素、金霉素和四環(huán)素的檢測(cè)中，高效液相色譜法是應(yīng)用最為廣泛的檢測(cè)方法，酶聯(lián)免疫分析法和膠體金免疫分析法也發(fā)展很快，同時(shí)逐漸出現(xiàn)了毛細(xì)管電泳法和微生物學(xué)法等檢測(cè)方法。這些檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，高效液相色譜法，尤其是HPLC—MS聯(lián)用技術(shù)，具有高靈敏度、高分離效率和高準(zhǔn)確度，但必須要有一定的測(cè)定儀器支持，前處理過程也較復(fù)雜，凈化程度要求較高，檢測(cè)成本較高，主要應(yīng)用于土霉素、金霉素和四環(huán)素殘留的定量測(cè)定。免疫學(xué)方法則具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏的特點(diǎn)，但準(zhǔn)確度則稍差，側(cè)重于大批量樣品的定性篩選檢出。在今后的研究中，抗生素類藥物替代品有很好的研究前景，像微生物制劑類生物藥品既能代替抗生素的功能，在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)揮重大作用，又不至于導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，對(duì)人類健康構(gòu)成重大威脅。同時(shí)應(yīng)致力于建立既簡(jiǎn)便、快速，又靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、檢測(cè)成本低的檢測(cè)方法，保證公共健康。

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